Anreicherung von T-Zell-depletierten NK-Zellen und deren zytotoxische Aktivität gegenüber ALL-Blasten in Abhängigkeit der HLA-Klasse-I-Expression.

Abstract

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode zur Anreicherung von NK-Zellen untersucht im Hinblick auf die Reinheit und Funktionalität der NK-Zellen und effektive Depletion der T-Zellen. Dabei wurde an eine Positivanreicherung der NK-Zellen mit CD56-MACS-Beads eine T-Zell-Depletion mit CD3-Dynabeads angeschlossen. Durchflußzytometrisch ergab sich nach beiden Schritten der Anreicherung eine Reinheit der CD56+/CD3- Zellen von 96,84 +- 3,34%, während der Anteil der T-Zellen 0,39 +- 0,29 % betrug. Damit lag die Reinheit der NK-Zellen im bzw. deutlich über dem Bereich, der in anderen Studien beschrieben wurde, die Ausbeute lag mit 71,4 +- 15,79% trotz des zweiten Schrittes über den in der Literatur bisher veröffentlichen Werten. Die Effektivität der T-Zell-Depletion wurde zudem funktionell in Proliferationsassays untersucht und zeigte eine deutliche Reduktion des alloreaktiven Proliferationspotentials der angereicherten Zellen. Die zytotoxische Funktionalität der angereicherten NK-Zellen wurde gegenüber der Zellinie K562 getestet und zeigte einen starken Anstieg nach den einzelnen Anreicherungsschritten gemäß dem höheren Anteil der NK-Zellen in der Effektor-Zell-Fraktion. Maximale Werte konnten dabei durch zusätzliche Stimulation über Nacht mit Interleukin 2 erzielt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die zytotoxische Aktivität der so angereicherten NK-Zellen gegenüber den Blasten pädiatrischer Patienten mit einer akuten lymphatischen Leukämie und deren Abhängigkeit von der Expression von HLA-Klasse-I- und Adhäsionsmolekülen auf den leukämischen Blasten untersucht. Gegenüber leukämischen Blasten zeigten die angereicherten NK-Zellen durchschnittlich nur eine geringe Spontanaktivität, da die NK-Zellen über eine Interaktion ihrer KIR-Rezeptoren mit den HLA-Molekülen der Blasten in ihrer Aktivität gehemmt wurden. Es zeigte sich allerdings eine sehr unterschiedliche Expressionsrate der HLA-Klasse-I-Moleküle, so differierten bei Leukämien der B-Zell-Reihe die Werte um den Faktor 33,6 zwischen 13149 und 441962 HLA-Moleküle/Zelle. Blasten mit geringer HLA-Expression ließen sich auch von unstimulierten NK-Zellen lysieren, während sich Blasten mit hoher HLA-Expression selbst den mit Interleukin 2 stimulierten NK-Zellen gegenüber resistent erwiesen. Für alle Blasten konnte jedoch gezeigt werden, daß sich durch die Blockade der HLA-Moleküle mit einem Antikörper die Lyse bis in den Bereich der Kontrollen mit K562 steigern lassen. Es fand sich außerdem eine Korrelation zwischen dem Grad der HLA-Klasse-I-Expression und der Lysierbarkeit der Blasten, die belegt, daß nicht nur alloreaktive NK-Zellen in der Lage sind, ALL-Blasten zu lysieren. Für die einzelnen untersuchten Adhäsionsmoleküle konnte kein signifikanter Zusammenhang gefunden werden. Außerdem konnte gezeigt werden, daß sich das inhibierende Signal der HLA-Klasse-I-Moleküle durch den Einsatz der ADCC überwinden läßt. Dazu wurden CD19+-Blasten im Zytotoxizitätstest vor Zugabe der NK-Zellen mit einem humanisierten CD19-Antikörper inkubiert. Die spezifische Lyse lag dann im Bereich der Lyse mit der HLA-Klasse-I-Blockade. Die hochangereicherten NK-Zellen könnten also nach einer allogenen Transplantation zur Behandlung einer MRD eingesetzt werden, v.a. im Falle einer haploidenten Transplantation, da nur ein minimales Risiko einer GvHD besteht. Bei Leukämien mit hoher HLA-Expression führten die Stimulation der NK-Zellen mit IL-2 und die Ausnutzung der ADCC in vitro zu guten Lyseraten und sollten für die Behandlung einer MRD in vivo eventuell ebenfalls kombiniert werden.

The transplantation of highly purified CD 34 + stem cells from haploidentical donors is a well established method in our institution for the treatment of children with high risk leukemias. However, relapses represent a major problem after transplantation. In these patients the treatment of minimal residual disease (MRD) by infusion of donor NK cells immediately after transplantation might be an approach to minimize the occurance of relapse without inducing graft-versus-host-reactions, but expression of HLA class I inhibits NK cell mediated cytotoxicity on tumor cells through killing cell inhibitory receptors (KIR). Therefore we investigated a method for the enrichment of highly purified NK cells and measured HLA class I expression using quantitative FACS analysis in leukemic cells from pediatric patients with acute lymphatic leukemia (ALL) and investigated the impact of HLA class I expression and several adhesion molecules on NK cell mediated lysis. In a first step, NK cells were enriched using CD56-beads from Miltenyi Biotech and in a second step remaining T cells were depleted with CD3 Dynabeads from Dako. Cytometry of the enriched cells shows a purity of CD56+/CD3- cells of 96,84 +- 3,34%, percentage of contaminating T cells was 0,39 +- 0,29 %. The efficiacy of T cell depletion was additionally tested in a mixed lymphocyte culture and shows a highly reduced alloreactive proliferation response for the enriched cells. Cytotoxic activity of the enriched cells was tested against the cell line K562. Enhanced cell lysis after the different steps of the enrichment procedure was obtained due to a higher percentage of NK cells in the effector cell fraction. By overnight incubation with interleukin 2 specific lysis of target cells could additionally be augmented. These highly purified and T cell depleted NK cells were tested against leukemic blast from pediatric patients with ALL. Blasts with reduced HLA class I expression were effectively lysed by donor NK cells after stimulation with IL2 , whereas blasts with high expression of HLA class I were more resistent to NK lysis. We found a linear correlation between number of HLA class I molecules and specific lysis of NK cells in an Europium release test (r2=0.54). The lysis could be strongly enhanced by blocking of HLA class I. Different patterns of adhesion molecules (ICAM 1-3, LFA 1+3) and CD95 were found without significant influence on NK cell lysis. In these experiments NK cell lysis was mainly dependent on HLA class I expression. We therefore suggest that screening leukemic blasts for HLA class I expression is valuable to choose a suitable immunotherapeutic strategy. Post transplant stimulation of the regenerating NK cells with IL2 in combination with donor NK cell infusions might be promising in the reduction of relapse rate.