Entwicklung eines polyklonalen Antiserums gegen "DRA", einem an der NaCl-Resorption beteiligten Anionenaustauscher

Abstract

Die Identifikation von DRA als einem an der NaCl-Resorption beteiligten Anionenaustauscher, und die Untermauerung der parallelen Anordnung zwischen Na+/H+- und Cl-/HCO3--Austausch waren wichtige Schritte im Verständnis der NaCl-Resorption im menschlichen Gastrointestinal-Trakt. Ebenso wichtig war die Aufklärung der Rolle von DRA in der Pathogenese der kongenitalen Chlorid-Diarrhoe. Der Zusammenhang zwischen Mutationen im DRA-Gen und der folglich auftretenden Diarrhoe wurde beschrieben. Untersuchungen bestätigten, dass das Chlorid-Diarrhoe verursachende Gen und das DRA-Gen identisch sind. Die physiologisch-biochemische Charakterisierung von DRA stellt einen unabdingbaren Schritt im Verständnis der Rolle dieses Proteins im menschlichen Organismus dar. vergangene Experimente trugen mit relevanten Informationen zum Verständnis dieses Proteins bei. Jedoch sind zahlreiche Fragen wie z.B. die möglichen Regulationsmechanismen der Expression, die Interaktion 25 mit anderen Proteinen auf zellulärer Ebene, die Lokalisation auf subzellulärer Ebene und mögliche Speziesunterschiede noch offen.

Für die weitere Charakterisierung von DRA ist daher die Entwicklung von "molekularen Werkzeugen" notwendig. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ein polyklonales Antiserum gegen DRA zu entwickeln, mit dem DRA in einem heterologen Expressionssystem und auch in physiologischen Systemen (endogen DRA-exprimierende Zelllinien, Biopsien, Resektaten) detektiert und möglichst auch isoliert werden kann. Insofern stellen ein Antiserum und eine heterolog DRA exprimierende Zelllinie molekulare Wekzeuge zur Charakterisierung von DRA dar.

Die für dieses Ziel durchzuführende Vorgänge werden zusammengefasst in:

A: Entwicklung eines Antikörpers, der das DRA-Genprodukt spezifisch als Antigen erkennt.

B: Transfektion/Expression einer humanen Zelllinie mit DRA.

C: Nachweis der DRA-Expression mit dem dafür zu entwickelnden Antikörper. Das für diese Zielsetzung geordnete Arbeitsprotokoll ist im einzelnen: 1. Der erste Schritt besteht aus der rekombinanten Expression von DRA in E.coli. 2. Dafür muß in großen Mengen (mindestens 1 mg) Antigen hergestellt werden. 3. Die Immunisierung der Kaninchen erfolgt mittels gereinigte Antigen. 4. Etablierung einer klonalen humanen Zelllinie mit DRA. Hierfür eignet sich die Transfektion von DRA in HEK 293-Zellen. 5. Der Erfolg dieser Transfektion bzw. eukaryotischen Proteinexpression wird in Western-Blots überprüft. Für die Antigen-Antikörper-Reaktion in Western-Blots wird das anti-DRA-Antiserum (aus Kaninchen) benötigt.

The two aims of the present study were on one hand the expression of the cytoplasmatic tail of DRA as a recombined protein to generate a polyclonal antibody and to test in vitro the interaction of DRA with other proteins, and on the other hand the heterologous expression of DRA in HEK cells to investigate with those the transport properties of DRA and the specification of the anti-sera. The following methods were applied: a recombined expression of the DRA C-terminal (aa 566-764) in E.coli as His-Tag fusion protein (C-DRA) and purification with a nickel resin, immunization of rabbits with C-DRA and controlling of the anti-sera on the immunogen by western-blots, transfection of HEK cells with DRA as His-myc fusion protein and the proof of the expression with an anty-myc antibody. As result one might state, that expression and purification of C-DRA are possible both with high output (> 1 mg/100 m Medium) and high purity (> 99 %). The interaction of other proteins with DRA might be tested in future in vitro with C-DRA.