Optimierung der Methode zum Gen - Transfer in synoviale Fibroblasten durch Transfektion

Abstract

Hauptziel dieser Arbeit war eine effiziente und im Rahmen der Zulassung des Labors als S1 Gentechniklabor sichere Gentransfer-Methode mit Hilfe von Transfektionsreagenzien zu etablieren um möglichst viel DNA in synovialen Fibroblasten anzureichern. Ein langfristiges Ziel ist es, mit erfolgreichen und gut etablierten Transfektionsmethoden die Mechanismen der IL-16 Expression und das Prozessing zur Sekretion zu erforschen. Dies kann unter anderem zur Therapie der rheumatoiden Arthritis beitragen. Im Verlaufe der Experimente wurde das Transfektionsreagenz FuGENE mit drei weiteren Reagenzien DOSPER, DOTAP und LIPOFECTAMINE verglichen um das effizienteste Verfahren herauszufinden. Ein weiteres Ziel der Versuche war es eine optimale DNA und Reagenzmenge für die Lipofektion zu bestimmen. Für diese Studie wurden neonatale dermale und adulte synoviale Fibroblasten eingesetzt. Zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung war es leider nicht möglich nur Gewebe von Rheumapatienten zu gewinnen. Die Biopsate stammten von insgesamt acht Patienten mit verschiedenen Arthritiden, wie Psoriasisarthritis, Arthrose und ein Patient mit RA. Als Vektoren dienten zwei verschiedene Plasmide. Zum einen das pUC-12 Plasmid, mit dem hGH Gen unter Kontrolle des RSV Promotors und zum anderen ein Plasmid mit EGFP Gen, welches für das Green Fluoreszenz Protein (GFP) kodiert und vom CMV Promotor gesteuert wird. Die in vitro Transfektion der Zellen mit dem DNA Reagenzkomplex wurde unter sterilen und äquivalenten Bedingungen durchgeführt. In den Zellüberständen vorhandenes hGH wurde durch ELISA nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass am meisten humanes Growth Hormon bei der Transfektion mit FuGENE exprimiert wurde. Bei der Lipofektion des EGFP Plasmids, wurde die darauffolgende zytoplasmatische GFP Expression mit Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Die Ergebnisse zeigten hier auch, dass die mit FuGENE transfizierten Zellen den höchsten Anteil an GFP positiven Fibroblasten hatten. Das Transfektionsreagenz FuGENE ist kaum zytotoxisch. Im Gegensatz zu anderen Reagenzien wie DOSPER und DOTAP, wiesen die Zellen beim Gentransfer mit FuGENE und LIPOFECTAMINE keine morphologischen Veränderungen auf. Diese Studie demonstrierte, dass FuGENE ein höchst effizientes Reagenz ist um synoviale Fibroblasten erfolgreich zu transfizieren und eignet sich dadurch zur Erforschung der IL-16 Expression und Sekretion.

The aim of this work was to establish an efficient and within the framework of the S1 gene technique laboratory, a safe gene-transfer method with transfection reagents in order to express as much DNA as possible in synovial fibroblasts. A longer term aim is to research the mechanism of IL-16 expression and secreted reporter proteins with well established transfection methods. This can also be helpfull for the treatment of rheumatoid arthritis. During the course of the experiments, the transfection reagent FuGENE was compared with three other reagents: DOSPER, DOTAP and LIPOFECTAMINE in order to find out the most efficient method. A different aim of the experiments was to determine the optimal ammount of DNA and reagents for the lipofection. For this study were used neonatal, dermal and adult synovial fibroblasts. At the time the experiences were carrying through was not possible to get tissue sample only from rheumatoid arthritis patients. The biopsates were taken from eight patients with different arthritides like: psoriasis arthritis, arthrosis and rheumatoid arthritis. Two different plasmids were used as vectors. PUC-12 plasmid with hGH gene under controll of RSV promotor and a plasmid with EGFP gene which was coding for Green Fluorescence Protein and was controlled by CMV promotor. The in vitro transfection of the cells with the DNA complex was carrying out under sterile and equivalent conditions. The secreted hGH protein was proved by ELISA. The results showed that the cells transfected with FuGENE expressed the most human Growth Hormon. After the lipofection of EGFP plasmid, the cytoplasmatic GFP expression became apperent by the fluorescence microscope. The results in this experiment showed also that, the fibroblasts transfected with FuGENE expressed a higher ammount of GFP. FuGENE transfection reagent has a low cytotoxicity. Compared with other transfection reagents like: DOSPER and DOTAP, the cells transfected with FuGENE and LIPOFECTAMINE doesn't show any morphological changes. This study demonstrated, that FuGENE is a very efficient reagent to transfect synovial fibroblasts successfully and is suitable for IL-16 expression and secretion research.