Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Gingiva-Fibroblasten auf mikrostrukturierten Titanoberflächen

Abstract

Untersuchungsgegenstand der Arbeit war ein Modellsystem für Zahnimplantate. Da in der dentalen Implantologie inzwischen vorwiegend Titan als Werkstoff eingesetzt wird, wurde Titan als Substrat verwendet und das Verhalten von Zellen darauf beobachtet. Die Anheftung von Zellen auf der Implantatoberfläche entscheidet über den Erfolg des Implantats. Die Topographie der Oberfläche und die Beschaffenheit des Materials beeinflussen wiederum das Verhalten von Zellen und die Expression von Adhäsions- und anderen Oberflächenmolekülen auf der Zelloberfläche, daher ist es wichtig, die Grenzfläche zwischen kultivierten Zellen und Metalloberfläche zu untersuchen. Im Mittelpunkt der Untersuchung standen mikrostrukturierte Oberflächen, da sich diese zum einen als besonders geeignet für die Beobachtung des Adhäsionsverhaltens von Zellen erwiesen haben und es sich zum anderen herausgestellt hat, dass sich Zellen auf strukturierten Oberflächen besser anheften als auf glatten. Als Substrate wurden Siliziumplättchen verwendet, in die ein Rillenmuster geätzt war. Diese wurden anschließend mit einer Titanschicht bedeckt. Auf diese Substrate wurden Fibroblasten aus Gingivagewebe ausgesät, und ihr Verhalten mit elektronen- und lichtmikroskopischen Methoden beobachtet. Folgende Fragestellungen wurden dabei untersucht: Kann durch das Hinzufügen von Mikrostrukturen und damit der Veränderung der Oberflächentopographie die Adhäsion der Zellen verbessert und die Ausbildung und Ausrichtung von Fokalkontakten gesteuert werden? Welche Rillengeometrie ist dabei am besten geeignet? Kann das System der ERM-Proteine und die damit verbundene Ausbildung von Oberflächenstrukturen auf der Zelle durch das Hinzufügen des Rillenmusters oder 'groove-ridge-design' gezielt aktiviert werden? Im ersten Teil der Arbeit wurde die Verteilung von Fokalkontakten auf verschiedenen Rillengeometrien mit Hilfe der Elektronenmikroskopie untersucht. Dazu wurden von den Siliziumplättchen zunächst Abdrücke in Araldit, einem in der Elektronenmikroskopie häufig benutzten Kunstharz, hergestellt, worauf die Zellen kultiviert und dann entweder mit konventioneller Technik in Araldit oder durch Tieftemperatur-Einbettung in Lowicryl eingebettet wurden. Die konventionelle Einbettung eignet sich dazu, die Anpassung der Zelle an die Mikrostruktur auf ultrastruktureller Ebene zu beobachten. Bei den Ultradünnschnitten der Tieftemperatur-Einbettung wurde im Anschluss noch eine Immunogold-Markierung des Proteins Vinculin zur Darstellung der Fokalkontakte durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Fokalkontakte vorwiegend in den Rillen, an deren Wänden oder an Unebenheiten im Substrat, die sich im Nanometer-Bereich befanden, und nicht auf den Stegen lokalisiert waren. Die Zellen orientierten sich an der Mikrostruktur und passten sich der Topographie der Oberfläche exakt an. Im zweiten Teil der Arbeit wurden an den Zellen, die auf mikrostrukturierten und titanisierten Siliziumplättchen wuchsen, die Proteine der ERM-Familie fluoreszenzmarkiert. Die Mitglieder dieser Proteinfamilie, Ezrin, Radixin und Moesin, sind an der Zellmembran lokalisiert. Dort binden sie zum einen direkt oder indirekt an Transmembranproteine, zum anderen an das Aktin-Zytoskelett. Ihr Vorkommen wurde vor allem in Zellen mit Membranausstülpungen und Oberflächenvergrößerungen, wie zum Beispiel Mikrovilli oder Filopodien beobachtet. Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen zeigten eine erhöhte Anzahl an Filopodien, daher war die Untersuchung der ERM Proteine von Interesse. Alle drei Proteine konnten durch Fluoreszenzmarkierung in den verwendeten Gingiva-Fibroblasten nachgewiesen werden. Es zeigte sich eine deutliche Färbung von Zelloberflächenstrukturen wie Mikrovilli und Filopodien auf allen titanisierten Substraten, unabhängig davon, ob diese mikrostrukturiert waren oder nicht. Zellen, die auf Glas, Silizium oder Kulturschalen-Plastik wuchsen, zeigten nicht diese ausgeprägte Färbung, sondern vor allem eine unspezifische zytoplasmatische Färbung. Die Zellen konnten also nur auf Titan-Substraten Mikrovilli und Filopodien ausbilden, die durch die ERM-Proteine induziert wurden und bei der Adhäsion (und Orientierung in der Umgebung) für die Zellen hilfreich waren. Dies unterstützt die Tatsache, dass sich Titan als äußerst biokompatibles Material für die Herstellung von Implantaten eignet. Die Zellen reagieren also auf die Beschaffenheit und Topographie des ihnen angebotenen Substrats mit der Aktivierung verschiedener Systeme und der Ausbildung spezieller Strukturen. Die Untersuchung dieser verschiedenen Reaktionen als Antwort auf chemisch und physikalisch unterschiedliche Substrate ist von Bedeutung für die Gestaltung von Implantatoberflächen und die Verbesserung der Zelladhäsion daran, damit Implantate langfristig stabil in das Gewebe integriert werden können.

Subject of the study is a model system for dental implants. Since today the main material used for dental implants is titanium, the behaviour of cells on titanium as a substrate was investigated. The adhesion of cells to the implant surface decides on the success of the implant. Thereby the topography of the surface and the composition of the implant material influence the behaviour of cells and the expression of adhesion and surface molecules at the cell surface. Therefore, it is important to examine the interface between cells and the surface of the material the cells are cultured on. The study was focussed on microstructured surfaces, since they are especially suitable for the observation of the adhesion of cells. In addition, it has been shown that cells adhere stronger to structured surfaces than to smooth surfaces. Groove-ridge patterns were etched into silicon substrates, which were then covered with a titanium layer. Subsequently, gingival fibroblasts were cultured on these substrates and their behaviour was examined using light and electron microscopy. The following questions were considered: Is it possible to improve cell adhesion and to direct the formation and orientation of focal contacts by adding microstructures to the surface of the substrate and thereby changing its topography? Which pattern is most suitable for this aim? Is it possible to control the activation of the ERM-proteins and the formation of cellular surface structures they induce by adding a groove-ridge-pattern to the surface of the substrate? In the first part of the study the distribution of focal contacts on diverse groove-ridge-patterns was examined by using electron microscopy. Therefore, the silicon substrates were first replicated in Araldite, a frequently used resin for electron microscopy. The cells were cultured on these replicas and then either embedded in Araldite by applying the conventional embedding technique or they were embedded in Lowicryl by applying the low-temperature-embedding technique. The conventional embedding technique is suitable to observe the adaptation of the cell to the microstructure at the ultrastructural level. Following the low-temperature-embedding procedure, the protein Vinculin was visualized by immunogold-labelling to label focal contacts. It could be shown that focal contacts form predominantly in the grooves, at the walls of the grooves or at uneven patches in the order of nanometers and do not localize on the ridges. The cells oriented themselves to the microstructure and adapted to the topography of the surface exactly. In the second part of the study the proteins of the ERM-family were fluorescence-labelled in cells growing on microstructured and titanium-coated silicon substrates. The members of this protein family, named Ezrin, Radixin and Moesin, are localized at the cell membrane. There, they bind on the one hand directly or indirectly to transmembrane proteins and on the other hand to the actin cytoskeleton. Their occurrence was mainly detected in cells forming membrane protrusions and surface enlargement, for example microvilli and filopodia. Because the electron microscopic studies showed enhanced formation of filopodia, it was of great interest to examine the expression of ERM-proteins. The three members of the protein family could be detected by immunofluorescence in gingival fibroblasts. A clear staining of cell surface structures like microvilli and filopodia was achieved on all titanium coated substrates that does not depend on microstructures. Cells growing on glass, silicon or tissue-culture plastic did not show this clear staining, instead their cytoplasm was unspecifically stained. Thus, cells were able to form microvilli and filopodia induced by the ERM-proteins only if they were growing on titanium substrates. These protrusions support cellular adhesion to the substrate and orientation within the environment. These results correspond with the fact that titanium is a highly biocompatible material that is successfully used for the production of implants. In summary, cells react to the composition and topography of the substratum they are exposed to. To be able to do this, they activate different cellular systems and form special structures. Studying the diverse reactions to chemically and physically different substrates is important for the design of implant surfaces and the improvement of cell adhesion to them in order to generate implants that are stably integrated into the tissue.