Comparison of different serological test-systems to analyse specific IgM and IgA immuneresponses against measles virus

Abstract

Hintergrund der Studie: Masern sind weltweit eine der führenden Ursachen für Kindersterblichkeit. In der Gruppe der Erkrankungen, die durch Impfstoff zu verhindernden wären, werden Masern für einen Grossteil der geschätzten 0,8 Millionen jährlichen Todesfälle verantwortlich gemacht. Die schnelle und zuverlässige Diagnose von Masern ist von grösster Wichtigkeit, um erkrankte Personen zu isolieren und empfängliche, nicht immune Personen zu impfen, um somit einen möglichen Ausbruch der Erkrankung zu verhindern. Durch die abnehmende Anzahl der Masernfälle sinkt die Diagnosesicherheit bei behandelnden Ärzten. Die Maserndiagnostik wird deshalb immer mehr von serologischen Testmethoden abhängig. Ein Anstieg von Masern-spezifischem IgM ist bezeichnend für eine akute Maserninfektion und wird deshalb weltweit zur Diagnose der Erkrankung verwendet. In der vorliegenden Studie wurden 4 IgM-Tests der neueren Generation mit Hilfe eines Panels von 225 IgM-positiven und -negativen Serum- und Plasmaproben (Panel A) durch Vergleich mit einem standardisierten Test (IgM-Enzygnost®) auf ihre diagnostische Validität und Reliabilität überprüft. Eine vorteilhafte Alternative zur Masernserologie sind diagnostische Speicheltests. Um die Güte der Speicheltests zu analysieren, wurde ein Panel mit 273 Serum- und Speichelproben (Panel B) zusammengestellt und im „Fluorescence-activated cell scanner“ (FACS) auf IgA, den im Speichel vorherrschenden Antikörper (Ak), gegen das Masernvirus H-Protein getestet. Material und Methoden: Panel A (n=225) beinhaltet Proben von Akutmasernpatienten, von genesenden Patienten, Eltern mit erkrankten Kindern sowie geimpften Personen aus Luxemburg und Nigeria. Die 4 verschiedenen IgM-Tests, die mit Hilfe des Panel A evaluiert wurden (Versuchsaufbau A), unterscheiden sich im Format und der Unterschiedlichkeit von Ak, die gemessen wurden. Die Gruppe der Tests bestand aus dem „Measles-IgM Comfort EIA“ („capture“ Format, „ready to use“-Kit), dem H-ELISA (basierend auf rekombinantem H-Protein), dem H-FACS und F-FACS (basierend auf, mit recombinantem H- oder F-Protein bestückten, humanen Melanomazellen). Alle Tests wurden mit dem Goldstandard (IgM-Enzygnost®, „indirect“ Format, „ready to use“-Kit) verglichen. Da die Auswertung stark von dem gewählten Cut-off, ab dem eine Probe als positiv gewertet wird abhängt, wurde zusätzlich eine Analyse unabhängig des Cut-offs vorgenommen (Bestimmung der „receiver operating characteristic curve“). Panel B, bestehend aus 273 Serum- und Speichelproben von geimpften, akut erkrankten- und genesenden Masernpatienten aus Luxemburg, Nigeria und Argentinien wurde auf Masern-spezifisches IgA mit Hilfe des H-FACS getestet (Versuchsaufbau B). Zusammenfassung der Ergebnisse: Im Versuchsaufbau A schnitt der „Measles-IgM Comfort EIA“ in der statistischen Auswertung und in der Einfachheit der Testdurchführung im Vergleich zum IgM-Enzygnost® am besten ab. H-FACS und H-ELISA zeigten eine leicht geringere Testgenauigkeit auf, können aber dennoch effizient in der wichtigen Periode nahe des Auftreten des Exanthems genutzt werden. Das F-FACS erwies sich in dieser Studie als eher schwacher Test in der Diagnose von Masern und benötigt weitere Verbesserungen der Testgenauigkeit. Im Versuchsaufbau B konnte keine sichere Differenzierung zwischen geimpften und von einer Maserninfektion genesenden Personen in Serum- und Speichelproben gemacht werden. Neu war jedoch die Entdeckung von IgA Ak gegen das Masern H-Protein in Speichelproben von Akutmasernpatienten bereits 8 Tage vor Einsetzen des Exanthems. Im Vergleich dazu konnten die entsprechenden Ak im Serum erst 1 Tag nach Einsetzen des Exanthems detektiert werden. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse zur Evaluation von 4 Masern spezifischen IgM-Tests zeigen, dass der Measles-IgM Comfort EIA ebenso zuverlässig Masern-spezifische IgM Ak detektieren kann wie der Goldstandard (IgM-Enzygnost®). Auch der H-ELISA ist zur Akutdiagnostik von Masern bis 19 Tage nach Einsetzen des Exanthems geeignet. Durch die Notwendigkeit von Zellkulturen ist der H-ELISA jedoch nicht vergleichbar anwenderfreundlich, wie die fertigen „ready to use“- Kits von Measles-IgM Comfort EIA und IgM-Enzygnost®. Zusätzlich zur Zellkultur ist beim H- und F-FACS ein grösserer Materialaufwand nötig. Aus den Ergebnissen der FACS Bestimmung von Masern spezifischen IgA Ak gegen das H-Protein ging interessanterweise hervor, dass IgA im Speichel 9 Tage vor IgA im Serum entdeckt werden konnte. Dies verstärkt den Verdacht, dass die lokale Immunreaktion des mit Masern infizierten Patienten schon während dem Eintreten des Virus durch die Barriere der Mukosa mit Bestimmung von IgA Ak im Speichel erkannt werden kann. Masern spezifisches IgA konnte allerdings auch in Serum und Speichel von geimpften und genesenden Masernpatienten gefunden werden. Deshalb ist IgA weder geeignet für schnelle und zuverlässige Maserndiagnostik, noch für die Unterscheidung von geimpften und genesenden Masernpatienten.

Backround of the study: Measles still ranks as one of the leading causes of childhood mortality in the world. In the group of vaccine-preventable diseases, measles is responsible for the most part of the estimated 0.8 million annual deaths. Especially in developing countries, it causes a frequent and fatal disease of young children because of background malnutrition and the risk of opportunistic secondary infections as a result of a transient cellular immunosuppression following acute measles. The number of measles cases has declined substantially mainly as a result of mass vaccination campaigns. However, it has also limited the experience of medical practitioners. Therefore, diagnosis relies increasingly on serological testing. Measles-specific IgM immune response is indicative for recent infection and therefore mostly used for detection of measles patients. In contrast to previous reports, a larger set of serum and plasma samples (n=225, panel A) was compiled and used for evaluation. The set of IgM assays were compared to the IgM-Enzygnost®, a standardized test, chosen to serve the gold standard. An interesting alternative to serum would be saliva-testing. Saliva is more convenient and, to some extend, a safer specimen. Most patients, especially children, would prefer to give saliva, than blood. IgA H-protein, supposedly the most effective antibody at the mucosal surface, was determined in a panel of 273 paired sera and saliva samples (panel B) using the “flourescence activated cell scanner” (FACS).

Materials und Methods: Panel A (n=225) consists of samples from acute measles patients, late convalescent patients, samples of parents with infected children and vaccinated individuals from Nigeria and Luxembourg. The 4 different IgM-assays, which were evaluated using panel A (experiment A) differed in the principle structure of each test and the subset of antibodies detected. The group of tests, including the Measles-IgM Comfort EIA (“capture” format, “ready to use”-kit), the H-ELISA (based on recombinant H-protein), the H-FACS and F-FACS (based on recombinant measles virus (MV)-H or -F protein measurements using H or F transfected human melanoma cell lines). All tests were compared to the gold standard (IgM-Enzygnost®, “indirect” format, “ready to use”-kit). Since the performance of each test severely depends on its cut-off value, evaluation was done with the standard characteristics (sensitivity and specificity) and additionally with the “receiver operating characteristic curves” (ROC), which do not depend on a discrimination threshold, but calculate the performance of each assay with all possible cut-off values. Panel B, includes 273 serum and plasma samples from vaccinated, acute phase and late convalescent measles patients from Luxembourg, Nigeria and Argentina. All samples were tested in the IgA H-FACS for measles-specific IgA antibodies (experiment B). Results and Discussion: In the experiment A, the Measles-IgM Comfort EIA gave best results in statistics and ease of test-performance, compared to the IgM-Enzygnost®. H-FACS and H-ELISA displayed slightly less accurate data-values. Still, both assays were efficient during the important time of onset of measles rash. The F-FACS was the rather weaker test in this study and needs further improvement in test accuracy for MV-IgM detection. In experience B, a correct distribution between vaccinees and late convalescents in serum and saliva cannot be observed in this way. However, the IgA H-FACS was able to detect IgA antibodies against measles in saliva of acute phase measles patients already 8 days prior to onset of rash. In contrast to saliva, IgA in serum samples was only displayed one day after onset of rash. Conclusion: Experiment A indicates, that the IgM-Comfort EIA is the most accurate test by its standard characteristics as well as by ROC analysis. The assay is comparable to the IgM-Enzygnost and could be used instead. The H-ELISA is suitable for the diagnosis of acute measles infection until 19 days after onset of rash. Due to the need of cell-culturing, the H-ELISA is not as user-friendly as the “ready to use”-kits, such as Measles-IgM Comfort EIA and IgM-Enzygnost®. Additionally to cell-culturing, the flow-cytometer required for FACS analysis, is not a standard equipment in every laboratory. Experiment B showed, that patients could be detected using saliva already 9 days before IgA was found in serum (8 days before compared to 1 day after onset of rash), strengthen the idea that the reaction of the body during the very early time of virus-entry through the mucosal barrier can be determined with saliva IgA-testing. Nevertheless, IgA was also found in serum and saliva of late convalescents and vaccinees. It is therefore not the isotype to be used for rapid measles diagnostic or for distinction between late convalescents and vaccinees.