Einfluss des Kofaktors NAD+/NADH der S-Adenosylhomocystein Hydrolase auf die Adenosinbindung

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dc.contributor.advisor Osswald, Hartmut de_DE
dc.contributor.author Lüdtke, Angelika de_DE
dc.date.accessioned 2004-01-16 de_DE
dc.date.accessioned 2014-03-18T09:34:24Z
dc.date.available 2004-01-16 de_DE
dc.date.available 2014-03-18T09:34:24Z
dc.date.issued 2003 de_DE
dc.identifier.other 109349482 de_DE
dc.identifier.uri http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-10549 de_DE
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10900/44438
dc.description.abstract Das Enzym SAH-Hydrolase katalysiert die reversible Hydrolyse von SAH zu Adenosin und Homocystein. Jedes Molekül SAH-Hydrolase enthält fest gebundenes NAD+, das als Kofaktor an der Reaktion beteiligt ist. Bindet Adenosin an die SAH-Hydrolase, wird das NAD+ zu NADH reduziert, und das Enzym geht in eine geschlossene, inaktive Form über. In der vorliegenden Arbeit wurde der Kofaktor NAD+ von der hochgereinigten SAH-Hydrolase aus Rindernieren entfernt und das Enzym mit definierten NAD+/NADH-Verhältnissen rekonstituiert. Untersucht wurde das Bindungsverhalten von Adenosin an die einzelnen Enzymformen. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Die Assoziationsgeschwindigkeit nahm mit steigendem NADH-Gehalt deutlich ab. So erreichte die vollständig oxidierte Enzymform schon nach 30 min das Gleichgewicht, während die vollständig reduzierte SAH-Hydrolase bis zur Einstellung des Gleichgewichts 8 Stunden benötigte. 2.Bei 3H-Adenosin-Konzentration bis 60 µM kann eine Sättigung der Enzymformen erreicht werden. Die Analyse nach Scatchard ergibt, abhängig vom NAD+/NADH-Gehalt der Enzymformen, eine bzw. zwei Bindungsstellen für Adenosin. Eine Bindungsstelle mit niedriger Affinität weisen die Enzymformen mit 90 bzw. 100% NAD+ und eine Bindungsstelle mit hoher Affinität die Formen mit 90 bzw. 100% NADH auf. Zwei Bindungsstellen findet man beim nativen Enzym und bei der Form mit 50% NADH. 3. Die Bestimmung der Adenosin-Bindungsstellen der SAH-Hydrolase mit Azido-Adenosin bestätigt die durch die Bindungsstudien gemachten Beobachtungen von 2 unterschiedlichen Bindungsstellen. Beim nativen Enzym wurden 2 markierte Peptide identifiziert. Bei der vollständig oxidierten Enzymform sowie bei der vollständig reduzierten Form konnte jeweils nur ein Peptid identifiziert werden. Diese entsprechen den jeweiligen Peptiden der nativen SAH-Hydrolase. de_DE
dc.description.abstract S-adenosylhomocysteine (SAH) hydrolase catalyzes the reversible hydrolysis of SAH to adenosine and homocysteine. Each molecule SAH contains tightly bound NAD+ which is a cofactor and part of the reaction. When adenosine binds to the SAH-hydrolase, NAD+ is reduced to NADH and the enzyme is transformed to its closed, inactive form. We used highly purified SAH-hydrolase from bovine kidneys, removed the cofactor NAD+ and reconstituted the enzyme with NAD+/NADH ratios between 1/0 and 0/1. Then we examined the adenosine binding characteristics of the different enzyme forms and received the following results: 1. The speed of association declined with rising contents of NADH. At a ratio of NAD+/NADH 1/0, steady state was reached within 30 minutes, whereas at a ratio of 0/1, it took 8 hours. 2. At concentrations of 3H-adenosine up to 60 µM, saturation of the enzyme with different NAD+/NADH ratios could be reached. Depending on the NAD+/NADH ratio of the enzyme, Scatchard analysis showed either one or two adenosine binding sites. SAH hydrolase in its native form and at a ratio of NAD+/NADH 0.5/0.5 exhibited two binding sites for adenosine with a KD1 of 9.2 +/- 0.6 nmol/l and a KD2 1.4 +/- 0.1 µmol/l, respectively. SAH hydrolase with NAD+/ NADH ratios of 1/0 and 0/1 revealed one binding site only, with a low affinity of 4.9 +/- 0.3 µmol/l and a high affinity of 48.2 +/- 2.7 nmol/l, respectively. 3. To identify the adenosine binding sites, SAH hydrolase was incubated with [2-3H]-8-azido-Ado. After irradiation, the reaction mixture was digested by Asp-N or trypsin and the peptides, purified by HPLC, were sequenced. It showed that the SAH hydrolase in its native form and at a ratio of NAD+/NADH 0.5/0.5 contains 2 different photolabelled peptides, whereas the examination of the NAD+ form and the NADH form revealed one photolabelled peptide only. These results match the finding of one or two adenosine binding sites, respectively. en
dc.language.iso de_DE de_DE
dc.publisher Universität Tübingen de_DE
dc.rights ubt-podok de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de de_DE
dc.rights.uri http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en en
dc.subject.classification Adenosin , Homocystein , NADH , Cofaktor de_DE
dc.subject.ddc 610 de_DE
dc.subject.other S-Adenosylhomocystein-Hydrolase , Apo-Enzym , Adenosin-Bindungsstellen , Azido-Adenosin , Kofaktor NAD+/NADH de_DE
dc.subject.other S-Adenosylhomocysteine hydrolase , Apo-enzyme , Adenosine binding sites , Azido-adenosine , NAD+/NADH ratio en
dc.title Einfluss des Kofaktors NAD+/NADH der S-Adenosylhomocystein Hydrolase auf die Adenosinbindung de_DE
dc.title The influence of the cofactor NAD+/NADH of the S-adenosylhomocysteine hydrolase on the binding characteristics of adenosine en
dc.type Dissertation de_DE
dcterms.dateAccepted 2003-11-11 de_DE
utue.publikation.fachbereich Sonstige de_DE
utue.publikation.fakultaet 4 Medizinische Fakultät de_DE
dcterms.DCMIType Text de_DE
utue.publikation.typ doctoralThesis de_DE
utue.opus.id 1054 de_DE
thesis.grantor 05/06 Medizinische Fakultät de_DE

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