Eignung lyophilisierter Glucose-Oxidase-haltiger Liposomen zur Korrektur der NADPH-Oxidase-Defizienz bei Granulozyten

Abstract

Neutrophile Granulozyten stellen die erste zelluläre Barriere bei der Abwehr pathogener Keime dar. Ihre mikrobizide Fähigkeit beruht zu großen Teilen auf der Bildung reaktiver Sauerstoffverbindungen im "oxidativen burst". Dieser ist in erster Linie das Ergebnis des Zusammenspiels der Enzyme Myeloperoxidase und NADPH-Oxidase. Von beiden Enzymen sind angeborene Defekte bekannt. Dabei bleibt die Myeloperoxidasedefizienz klinisch meist inapparent, während die NADPH-Oxidase-Defizienz zum schweren Krankheitsbild der Septischen Granulomatose führt. Durch H2O2-generierende Glucose-Oxidase-haltige Liposomen (GOL) kann die Funktionalität neutrophiler Granulozyten in vitro rekonstituiert werden. Die GOL sind in wässriger Lösung allerdings nur von begrenzter Haltbarkeit. Die Lyophilisation stellt einen Ansatz zur Verbesserung der liposomalen Haltbarkeit dar. Im Rahmen des ersten Teils dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Wirkungen lyophilisierter GOL auf Neutrophile mit denen konventionell hergestellter vergleichbar sind. In Aufnahmeuntersuchungen mittels FACS-Analyse konnte gezeigt werden, dass lyophilisierte Liposomen in vergleichbarem Maße wie konventionell hergestellte Liposomen selektiv durch phagozytäre Zellen aufgenommen wurden. Weiterhin wurden Untersuchungen zur Abklärung der intrazellulären Lokalisation von Liposomen durchgeführt. Mit Hilfe der konfokalen Lasermikroskopie konnte nachgewiesen werden, dass die Liposomen innerhalb des Neutrophilen mit vorher phagozytierten Staphylococcus aureus kolokalisiert sind. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte sich schließlich die intraphagolysosomale Lage der Bakterien und Liposomen. In photometrischen Assays und mittels Chemilumineszenz konnte gezeigt werden, dass NADPH-Oxidase-defiziente Granulozyten nach Inkubation mit lyophilisierten Liposomen in ähnlichem Maße wie konventionell hergestellte zur Bildung von reaktiven Sauerstoffverbindungen, insbesondere von HOCl, in der Lage sind. Bei Betrachtung der unerwünschten Wirkungen der GOL zeigte sich, dass die chemotaktischen Fähigkeiten der Neutrophilen durch lyophiliserte GOL – ähnlich wie durch konventionell hergestellte lediglich gehemmt, nicht aber aufgehoben wurden. Auch die Bildung von Lipidperoxidationsprodukten lag in Größenordnungen, die durch physiologische Aktivierung von Neutrophilen erreicht wird. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die Wirkungen der GOL nicht auf der Degranulation von Granulainhalten ins Außenmedium beruhen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Stabilität der Glucose-Oxidase (GO) gegenüber zellulären Einflüssen, insbesondere pH-Wert-Änderungen, oxidativen Stress und granulozytären Inhaltsstoffen. Hier konnte gezeigt werden, dass es innerhalb des Untersuchungszeitraums von zwei Stunden bei keiner der untersuchten Einflüssen zu einer nennenswerten Aktivitätsminderung kam. Die Lyophilisation stellt einen durchaus beachtenswerten Ansatz zur Verlängerung der Haltbarkeit von GOL dar und kann für eine Anwendbarkeit in vivo in Betracht gezogen werden. Die GO scheint gegenüber aktivitätsmindernden Einflüssen relativ stabil zu sein und ist daher für die H2O2-Bildung im aggressiven Milieu des Phagolysosoms sehr gut geeignet.

Neutrophils constitute the first cellular barrier against pathogen germs. Their microbiocidal properties are overwhelmingly derived from the ability to produce reactive oxygen species in the ocidative burst. The oxidative burst is first and foremost the result of the interacting enzymes myeloperoxidase and NADPH-oxidase. Hereditary defects are known for either of the enzymes. While myeloperoxidase deficiency stays clinically inapparent in most cases NADPH-oxidase deficiency results in a serious illness referred to as chronic granulomatous disease. By administration of glucose-oxidase-containing liposomes (GOL) that generate H2O2 neutrophil function can be restored in vitro. GOL, however, are of limited shelflife when stored in aquaeos solution. Lyophilization of liposomes provides an approach to improvement of liposomal shelflife. The first part of this thesis deals with the effects of lyophilized GOL as compared to conventional ones. FACS-analysis showed that lyophilized liposomes were taken up selectively by phagocytes and uptake rates were comparable to those of conventional liposomes. Confocal laser microscopy provided data proving co-localisation of liposomes and phagocytosed stapylococcus aureus within neutrophils. Moreover, electron microscopy showed bacteria and liposomal containts within the same phagolysosome. Using both photometric assays and chemiluminescence it was shown that incubation of NADPH-oxidase-deficient neutrophils with lyophilized liposomes restored cellular ability to produce reactive oxygen species, especially hypochlorite, in a range comparable to that of conventional liposomes. Experiments focusing on potential side effects of showed that chemotactic properties of neutrophils were only hampered but not fully neutralized by incubation with lyophilized GOL – as shown earlier for conventional GOL. Additionally, constitution of lipid peroxidation products did not exceed levels reached by physiologic neutrophil activation. Finally, it was shown that the effects cause by GOL were not due to degranulation of neutrophil granule containts into extracellular matrix. Within the second part of this thesis stability of glucose oxidase (GO) against cellular agents and intracellular environments, namely changes in pH-value, oxidative stress and granulocyte containts was examined. It became apparent that within the examination time of two hours no significant loss of enzyme activity was detected. Concludingly, lyophilization does indeed provide a remarkable approach to shelf life improvement of GOL and can therefore be taken into consideration for in vivo suitability examinations. GO seems to be relatively stable towards potential activity altering agents and is thus very suitable for providing H2O2 within the aggressive environment of the phagolysosome.