Untersuchungen zur Zytotoxizität des Farnesyltransferaseinhibitors FTI-277 im Knochenmarks-Stammzell-Assay CFUc

Abstract

Untersuchungen zur Zytotoxizität des Farnesyltransferaseinhibitors FTI-277 im Knochenmarks-Stammzell-Assay CFUc

Farnesyltransferaseinhibitoren (FTI) repräsentieren eine neue Gruppe selektiver Chemotherapeutika. Sie erwiesen sich im Einsatz gegen unterschiedliche Malignome in bisher durchgeführten präklinischen Studien als hochpotent. Ihre antineoplastische Wirkung erklärt sich über die Hemmung der in vielen Zellen stattfindenden Farnesylierungsreaktionen, welche für eine Vielzahl von zellu-lären Proteinen ein entscheidender Schritt im Rahmen posttranslationeller Modifikationen darstellen. Die ausbleibende Farnesylierung führt letztlich u.a. dazu, dass aktivierte Onkogene ihre Funktion verlieren oder sogar in ihren nicht transformierten Phänotyp zurückversetzt werden. Entwickelt wurden die FTIs als Ras-Inhibitoren. Inzwischen weiß man allerdings, dass dieses in mensch-lichen Tumoren am häufigsten mutierte Onkogen nur ein Angriffspunkt unter vielen ist und vermutlich eher am Ende einer durch FTIs ausgelösten Kaskade inaktiviert wird, an deren Anfang ein bisher noch nicht identifiziertes anderes Protein steht. Neben ihrem breiten Wirkspektrum machten FTIs vor allem wegen ihrer im Rahmen von in vitro- und in vivo (Mausmodelle)-Untersuchungen beobachteten sehr geringen Toxizität auf sich aufmerksam. Diese Eigenschaft unterscheidet sie wesentlich von der Mehrzahl der bisher eingesetzten antineoplastischen Wirkstoffe, bei denen vor allem eine Myelosuppression häufig als dosis-limitierende Nebenwirkung auftritt. Ziel dieser Arbeit war es nun, die geringe Zytotoxizität nicht wie bisher im Rahmen der Behandlung von Tumor-tragenden Mäusen, sondern an intakten Knochenmarkszellen aus dem peripheren Blut gesunder Spender zu über-prüfen. Dazu wurden die Zellen in CFUc-Assays mit dem peptidomimetischen FTI-277 inkubiert und die Zahl der aus hämatologischen Vorläuferzellen ent-standenen Kolonien anschließend nach elftägiger Inkubation ausgezählt. Durch den Vergleich des Koloniewachstums der allein mit dem Lösungsmittel DMSO behandelten Zellen mit völlig unbehandelten Kontrollassays zeigte sich, dass DMSO selbst zytotoxisch wirkt und ab einer Konzentration von 0,8 Vol% zu einem deutlichen Rückgang der Koloniebildung im Assay führte. DMSO ist daher als Lösungsmittel für FTI-277 eher ungeeignet. Für weitere Versuche wurde deshalb Ethanol als Lösungsmittel ausgetestet. Im Gegensatz zu DMSO ergaben sich hier keine signifikanten Lösungsmittel-induzierten Effekte, so dass Ethanol für Untersuchungen der FTI-Wirksamkeit eher zu empfehlen ist. Im Rahmen der Untersuchungen zur Zytotoxizität von FTI-277 auf Knochen-markszellen zeigte sich in den CFUc-Assays im Bereich von 5-80 mM eine deutliche konzentrationsabhängige Hemmung der Koloniebildung mit einer IC50 von 40 mM. Eine weitere Dosisverdopplung auf 80 mM reichte aus, um die Bildung hämatopoetischer Kolonien vollständig zu inhibieren. Außerdem waren die einzelnen Kolonien in Gegenwart des FTIs kleiner als diejenigen der unbehandelten Kontrollassays (DMSO oder Ethanol). Die im Rahmen dieser Untersuchungen festgestellten Effekte von FTI-277 auf gesunde Knochenmarkszellen wurden zwischenzeitlich auch in ersten Phase I-Studien mit verschiedenen FTIs bestätigt.

Investigations of Cell Toxicity of the Farnesyltransferase Inhibitor FTI-277 within the Bone Marrow Stem Cell Assay CFUc

Farnesyltransferase inhibitors represent a new group of more selectively working chemotherapeutics. Preclinical experiments proved them to be highly potent against various malignancies. Their antineoplastic potency can be explained by the inhibition of reactions of farnesylation that take place in many cells and which are one of the major steps within posttranslational modifications. Due to the lack of farnesylation, activated oncogenes lose their function and are retransformed into their former phenotype. FTIs were developed as inhibitors of Ras. Today we know that this oncogene is only one of the targets of FTIs. It is inactivated rather at the end of a cascade that was started by FTIs whereas another protein, which could not be identified yet, is placed at the beginning.

Apart from their broad spectrum of action, FTIs gained attention because of their very low toxicity during investigations in vivo and in vitro. This characteristic feature gives them an advantage over most of the other antineoplastic agents previously used which often showed myelosuppression to be their dose limiting toxicity.

This dissertation's aim is the verification of the low cellular toxicity not only with regard to tumor-baring mice-models but also to vital bone marrow cells taken out of the peripheral blood of healthy donors. Therefore these cells were incubated with peptidomimetic FTI-277 and the number of colonies formed out of hematological precursor cells was counted after eleven days. By comparing the resulting number of colonies that were treated only with the solvent DMSO with cells that were not treated at all, it could be ascertained that DMSO itself is cytotoxic. This results in a decline of colony formation. Therefore DMSO can not be recommended as a solvent for FTI-277. For further experiments ethanol was used as a solvent. In contrast to DMSO, ethanol showed no significant solvent-based toxic effects and can be recommended as a potent solvent for FTI-277. During the course of investigating the cellular toxicity of FTI-277 to bone marrow cells the formation of colonies was inhibited depending on the concentration between 5 and 80 mM with an IC50 of 40 mM. Only 80mM were sufficient to inhibit colony formation completely. The formed colonies were also smaller in the presence of FTI compared with the colonies formed in the presence of just ethanol or DMSO. The effects of FTI-277 analyzed in this dissertation have in the meantime been confirmed in first phase-I-trials with various FTIs.