Methodenvergleich zum Nachweis von "Anti-Neutrophil-Cytoplasmic Antibodies" (ANCA) und klinische Relevanz der ANKA bei Patienten mit chronischen Erkrankungen unter besonderer Berücksichtigung autoimmuner Lebererkrankungen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Verfahren zum Nachweis von Anti-Neutrophil-Cytoplasmic Antibodies (ANCA) verglichen und die Prävalenz dieser Antikörper bei verschiedenen Erkrankungen (autoimmune Lebererkrankungen, Vaskulitiden) sowie ihre Assoziation mit anderen serologischen Markern untersucht. Für den Immunfluoreszenztest (IFL) wurden Objektträger mit Granulozyten von 10 verschiedenen Spendern angefertigt und ausgetestet; ferner wurden unterschiedliche Fixationsmethoden (Äthanol vs. Methanol und Formalin) untersucht. Die Patientenseren wurden zusätzlich im ELISA und Westernblot gegen Granulozyten getestet. Nur von zwei der getesteten zehn Spender konnten Granulozyten isoliert werden, die sich zum Nachweis von ANCA im Immunfluoreszenztest (IFL) eigneten. Fixation mit Methanol führte zu reproduzierbareren Ergebnissen als die mit Äthanol oder Formaldehyd. ANCA mit einem perinukleären Fluoreszenzmuster (pANCA) waren vor allem bei Patienten mit primär sklerosierender Cholangitis (PSC), autoimmuner Hepatitis (AIH), chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Vaskulitiden nachweisbar, ein zytoplasmatisches Fluoreszenzmuster (cANCA) war in erster Linie bei Patienten mit primär-biliärer Zirrhose und M. Wegener zu beobachten. Unter standardisierten Testbedingungen, lag bei der PSC die Prävalenz der ANCA bei 79%, bei der AIH bei 73%, bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen bei 56%(M. Crohn) bzw. 86% (Kolitis ulcerosa). 87% der PBC Patienten waren AMA positiv, 40% von ihnen zeigten ein cANCA Muster. Bei diesen Patienten waren IgM- und Gesamtbilirubinspiegel signifikant häufiger erhöht als bei ANCA negativen. Der ELISA mit Granulozyten eignete sich nicht zur Detektion von ANCA. Bei der Untersuchung von Patientenseren mit dem Westernblot konnten zwei Determinanten bei 35 und 95kD identifiziert werden, mit denen spezifische Seren von Patienten mit PSC und Kolitis ulcerosa reagierten. Diese Befunde machen einerseits die Problematik in der Standardisierung des Nachweises von ANCA deutlich, belegen aber andererseits, dass mit Hilfe eines gut etablierten Testsystems der Nachweis von p- oder cANCA einen sinnvollen Parameter in der Diagnostik nicht nur der Vaskulitiden sondern auch der autoimmunen Lebererkrankungen darstellt. Der Nachweis identischer Determinanten mit Westernblot bei Patienten mit PSC und Kolitis ulcerosa weist auf einen gemeinsamen Antigenkomplex und damit möglicherweise einen gemeinsamen pathogenetischen Mechanismus bei beiden Krankheitsbildern hin. Der Nachweis von ANCA mit einem atypischen zytoplasmatischen Muster bei Patienten mit PBC die nicht mit den bekannten AMA-Spezifitäten zu korrelieren scheinen, könnte auf einen weiteren zytoplasmatischen Antigen/Antikörperkomplex bei dieser Erkrankung hinweisen, der möglicherweise mit der Krankheitsaktivität korreliert. Eine weitere Identifizierung der Targetantigene von ANCA wäre daher ein wichtiger Schritt in der Einordnung ihrer diagnostischen und ätiopathogenetischen Relevanz.

In the following study, several different methods for the detection of anti-neutrophil-cytoplasmic antibodies (ANCA) were compared with each other and the prevalence of these antibodies in various diseases (autoimmune liver diseases, vasculitis) as well as their association with other serological markers was examined. Microslides with granulocytes from 10 different persons were made and tested with the immunofluorescence test (IFL); furthermore, different methods of fixation (ethanol vs. methanol and formalin) were examined. The patient’s serums were further tested in ELISA and Western blot for granulocytes. Granulocytes could only be isolated in two of the ten donors, which were then suitable for the detection of ANCA in the immunofluoresence test (IFL). Fixation with methonal produced more reiterable results than fixation with ethanol or formaldehyde. ANCA with a perinuclear fluorescent pattern (pANCA) were observed mostly in patients with primary sclerosing cholangitis (PSC), autoimmune hepatitis, inflammatory bowel diseases, and vasculitis; a cytoplasmic fluorescent pattern (cANCA) was observed primarily in patients with primary-biliariy cirrhosis and Wegener’s granulomatosis. Under standardised test conditions, the prevalence of ANCA in PSC stood at 79%, in AIH at 73%, and in patients with inflammatory bowel diseases at 56% and 86% for Crohn’s disease and ulcerative colitis respectively. 87% of the PBC patients were AMA-positive; 40% showed a cANCA pattern. These patients had a significant, more frequently heightened IgM and total bilirubin level than those patients who were ANCA-negative. The ELISA with granulocytes was not suitable for the detection of ANCA. In the examination of patient serums with Western blot, two determinants were identified at 35 and 95kD that reacted with specific serums from patients with PSC and ulcerative colitis. These results demonstrated on the one hand the problems associated with the standardisation of the detection of ANCA, however, on the other hand, these results verify that, with the help of a well established test system, the detection of pANCA or cANCA offers a useful parameter in the diagnosis not only of vasculitis but also of autoimmune liver diseases. The detection of identical determinants with Western blot in patients with PSC and ulcerative colitis indicates an antigen complex common to both, and therefore potentially indicates a pathogenetic mechanism common to both illnesses. The detection of ANCA with an atypical cytoplasmic pattern in patients with PBC that do not appear to correlate with known AMA-specificities could indicate an additional cytoplasmic antigen/antibody complex in connection with this illness that possibly correlates with illness activity. A further identification of the target antigen of ANCA would therefore be an important step towards the classification of its diagnostic and aetiopathogenetic relevance.