Bedeutung und funktionelle Charakterisierung des Transkriptionsfaktors Egr-1 für die Pathogenese der rheumatoiden Arthritis

Abstract

Der Trankriptionsfaktor Egr-1 (immediately early gene response-1) gehört zu den DNA-bindenden Zinkfingerproteinen und stellt ein frühes Aktivierungsgen dar. Egr-1 ist ein induzierbarer Transkriptionsfaktor, der die Expression vieler Gene, die in inflammatorischen Prozessen involviert sind, reguliert. Möglicherweise spielen Transkriptionsfaktoren eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der rheumatoiden Arthritis. Wie frühere Arbeiten von Aicher et al. (1994) und Grimbacher et al. (1998) zeigten, wird Egr-1 in synovialen Fibroblasten von RA Patienten vermehrt exprimiert. Ziel der Arbeit war, Egr-1 stabil oder transient in synovialen Fibroblasten zur Überexpression zu bringen um seine regulatorische Wirkung auf die Egr-1 abhängige Genexpression direkt untersuchen zu können. Für diese Versuche wurden synoviale Fibroblasten mit dem SV 40 large T-Antigen immortalisiert und mit dem rekombinanten Maus-Egr-1 stabil transfiziert. Nach der Überprüfung der Egr-1 Expression auf Transkript- und Proteinebene, wurden mittels differentialer Genexpressionsanalyse (RAP-PCR) Gene ausfindig gemacht, die in den entstandenen Klonen differentiell exprimiert wurden. Ein Gen, das in den Klonen stark unterschiedlich exprimiert wurde, zeigte nach dem Vergleich mit der Gen-Bank eine 100%-ige Homologie mit der a1-Kette des Typ I Kollagens. Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden zwei aus unterschiedlichen Transfektionsserien stammenden Klon-Paare mittels quantitativer Echtzeit-PCR auf die Expression beider Ketten (a1 und a2) des Typ I Kollagens näher untersucht. In beiden Klon-Paaren korrelierte die Egr-1 Überexpression mit einer gesteigerten Kollagen Typ I Genexpression. Auf Proteinebene konnten sowohl mittels ELISA als auch Western Blotting höhere Kollagen I Expressionsniveaus im Egr-1 überexprimierenden Klon aus der ersten, nicht jedoch aus der zweiten Transfektionsserie nachgewiesen werden. Weiterhin konnte in beiden Egr-1 überexprimieren-den Klonen eine gesteigerte TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases), TIMP-3 und Kollagen Typ II Expression auf Transkriptebene beobachtet werden. Um auszuschließen, dass es sich bei der stabilen Transfektion um Klonierungsartefakte handelt, wurde eine transiente Transfektionsmethode an einer Fibrosarkom-Zellinie (HT1080) etabliert. Auch in diesen Zellen korrelierte die Egr-1 Überexpression mit einer gesteigerten Kollagen Typ I und II sowie TIMP-1 und TIMP-3 Genexpression im Vergleich zur nicht transfizierten Kontrolle oder zur Durchfluß-Fraktion, bei der die Expression dieser Gene ebenfalls auf niedrigem Niveau blieb. Die Anwendung eines induzierbaren Ecdyson-Expressionssystems brachte ähnliche Ergebnisse wie bei der stabilen und der transienten Transfektion. Eine Egr-1 Überexpression in den humanen embryonalen Nierenzellen (EcR 293) korrelierte mit einer erhöhten Kollagen Typ I, Typ II und TIMP-3, jedoch nicht mit einer verstärkten TIMP-1 Genexpression. Promotoruntersuchungen mit dem TIMP-1 Wildtypkonstrukt bzw. mit der Promotormutante, der die Egr-1 Bindungsstelle fehlte, bestätigte die Vermutung, dass Egr-1 die TIMP-1 Expression über einen direkt am Promotor wirkenden Mechanismus beeinflusst. Im Gegenteil dazu führten Promotorexperimente mit dem Kollagen I Wildtyppromotor bzw. mit verschiedenen Promotormutanten zu dem Ergebnis, dass Egr-1 die Kollagen I Expression womöglich nicht über einen direkten Mechanismus zu steuern scheint. Weil in Egr-1 überexprimierenden Zellen gleichzeitig die Expression von Kollagen I, II und TIMP-1, dem Inhibitor der interstitiellen Kollagenase, induziert wurde, wurde angenommen, dass Egr-1 eine Rolle bei der Entstehung eines fibrosierenden Prozesses im Gelenk des Rheuma-Patienten, spielen könnte. Metalloproteinasen sind Enzyme, die Bestandteile der extrazellulären Matrix, vor allem Kollagene, degradieren. Eine gleichzeitige Induktion des Inhibitors der interstitiellen Kollagenase (TIMP-1) und der Kollagen I Expression würde das Gleichgewicht zwischen knorpel-auf- und –abbauenden Prozessen, das im normalen, gesunden Gewebe besteht, zugunsten einer Fibrosierung stören. Diese Vermutung wird weiterhin durch andere Studien unterstützt, die dem Transkriptionsfaktor Egr-1 eine wichtige Rolle bei der Entstehung der interstitiellen Fibrose bei der Ratte (Nakamura et al., 2002) zukommen liessen. Die Einführung eines DNA-Enzyms, das die Egr-1 RNA spaltet, führte zur Reduktion der Egr-1, TGF-ß und Kollagen I Expression und somit zur verminderten interstitiellen Fibrose. Die weitere Aufklärung der detaillierten Signaltransduktionswegen, die spezifisch sind für das Krankheitsbild der RA, könnte in der Zukunft dazu führen, dass neue Therapieformen für die RA entwickelt werden.

The transcription factor Egr-1 (immediately early gene response-1) is a DNA-binding zinkfinger protein. This inducible transcription factor regulates the expression of several genes implicated in inflammatory processes. Transcription factors may possibly play an important role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Studies in synovial fibroblasts from RA patients showed that the transcriptionfactor Egr-1 is expressed at elevated levels (Aicher et al., 1994; Grimbacher et al., 1998). The aim of this study was to overexpress Egr-1 in immortalized synovial fibroblasts to examine its regulatory influence on the Egr-1 dependent gene expression. For this porpose synovial fibroblasts from one RA patient were immortalized with the large T-Antigen from SV40 and stably transfected with the recombinant mouse Egr-1. After analysis of recombinant Egr-1 on transcript and protein levels, differentially expressed genes in Egr-1 high and low clones were detected by RAP-PCR. One gene was shown to be induced in the Egr-1 high clone in comparison to the Egr-1 low control and was further characterized. This gene encoded the a1-chain of type I collagen, as determined by DNA sequencing followed by BLAST search. To confirm these results, a quantitative RT-PCR was employed to examine the gene expression of the a1- and a2-chain of type I collagen in clones derived from two independent transfection series. In both Egr-1 high clones elevated copy numbers of type I collagen in comparison to the respective controls were found. Elevated type I collagen protein levels were detected by ELISA and immunoblotting in the Egr-1 high transfectants versus controls derived from the first transfection series. However, detection of the collagen protein in supernatants from the second transfection series could not be achieved because of the much lower expression levels in these cells. Furthermore, higher transcription levels of TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases), TIMP-3 und type II collagen were quantitated in both Egr-1 high clones derived from different transfection series. To exclude that the inductive effect of Egr-1 on the expression of type I collagen was not an artefact caused by the cloning methodology, a transient transfection method with the recombinant mouse Egr-1 was established. For these experiments a fibrosarcoma cell line was used (HT1080). In transient transfected fibrosarcoma cells a strong and reproducible up-regulation of type I and type II collagen, TIMP-1 and TIMP-3 gene expression could be detected in comparison to the untransfected and run-through cell fraction. In addition, for further transient transfection experiments an ecdysone-inducible mammalian expression system was used. An overexpression of the recombinant mouse Egr-1 in the human embryonal kidney cells (EcR293), which were utilized for this system, correlated with elevated type I, type II collagen and TIMP-3, but not with TIMP-1 transcription levels. Promoter reporter assays with the wild-type TIMP-1 promoter as well as with a promoter mutant, which failed the Egr-1 binding site, confirmed the assume that Egr-1 may directly regulate the TIMP-1 promoter. In contrast, promoter reporter assays with the wild-type collagen I promoter and three different deletion mutants showed that the Egr-1 activation of type I collagen expression may be not based on a direct mechanism. The fact that Egr-1 overexpressing cells showed induced levels of type I and type II collagen and at the same time an induction of the inhibitor of metalloproteinases TIMP-1 indicates an important role of Egr-1 during the development of a fibrotic process in the joint of RA patients in the course of disease. As suggested by a recent study examining the role of Egr-1 in obstructed kidneys, targeting of Egr-1 using a DNA-enzyme reduced TGF-ß and type I collagen I expression and inhibited consequently interstitial fibrosis. Further explanation of signal transduction pathways that are typical for RA could represent an important approach in order to develop new therapeutic agents.