Expression des protein inhibitor of nitric oxide synthase in der Retina adulter Ratten

Abstract

Das Axotomiemodell des Nervus opticus dient als Paradigma für Nervenverletzungen im zentralen Nervensystem von adulten Säugetieren. Innerhalb von zwei Wochen nach Transektion des optischen Nerven kommt es zu einem Zellverlust von 80-90% der retinalen Ganglienzellen. Erhöhte Neurotrophinspiegel in der Retina reduzieren die Zahl des überwiegend apoptotischen Zelluntergangs. Intravitreal verabreichte Radikalfänger, die den Auswirkungen einer erhöhten Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) unter der Neurotrophingabe entgegenwirken, vermögen diesen apoptotischen Zelluntergang zu inhibieren.

NO-Konzentrationen im ZNS werden zu einem Großteil durch das NO-produzierende Enzym Stickstoffmonoxidsynthase (NOS) reguliert. Die Aktivität von NOS kann durch den protein inhibitor of nitric oxide synthase (PIN) reduziert werden. Zielsetzung dieser Arbeit ist zu klären, ob durch vermehrte Expression von PIN in überlebenden retinalen Ganglienzellen auf das Trauma der Axotomie reagiert wird.

In der vorliegenden Arbeit wird die Expression PINs zwischen axotomierten und Kontrollretinae adulter Ratten verglichen. Mittels mRNS-Sonden und monoklonalen Antikörpern wird die schichtenspezifische Verteilung der PIN-mRNS bzw. des PIN-Proteins in der Retina lokalisiert. Durch semiquantitive-, Echtzeit-PCR und Western blots werden zeitliche und quantitative Bestimmung der Expression- und Translationsmuster untersucht. In Kolokalisationsexperimenten mit PIN- und nNOS-Antikörpern wird deren räumliche Verteilung in der Retina dargestellt.

Sowohl axotomierte (ARe) als auch Kontrollretinae (KRe) zeigen die stärkste Akkumulation von PIN-mRNS in der retinalen Ganglienzellschicht und in der inneren Körnerzellschicht. Eine vermehrte Expression PINs in den einzelnen Ganglienzellen von ARe im Vergleich zu KRe ist nicht nachweisbar. Die quantitative Bestimmung der mRNS von ARe und KRe zu den Zeitpunkten 6 h, 12 h, 1 d und 3 d mittels PCR zeigt in Übereinstimmung mit den Befunden aus der ISH keine wesentlichen Expressionsunterschiede. Durch immunhistochemische Doppelfärbung mit Antikörpern gegen PIN und neuronaler NOS konnten beide Proteine in retinalen Ganglienzellen kolokalisiert werden. Aus den immunhistochemischen Experimenten und Western blots liegen keine Hinweise auf eine vermehrte Expression des PIN-Proteins in ARe vor. Die Einordnung der Ergebnisse und PINs eventuell zusätzliche Beteiligung am Dyneinmotorkomplex werden vorgestellt und diskutiert. Für eine vermutete Hochregulation PINs in retinalen Ganglienzellen nach Axotomie geben weder die vorliegenden Daten auf mRNS- noch auf Proteinebene einen Anhalt.

After transection of the optic nerve (ON), the majority of retinal ganglion cells (RGCs) degenerate and die within two weeks. This neuronal cell death is mainly apoptotic. Increased intraoccular levels of neurotrophins are able to augment the number of surviving RGCs. There is growing evidence that neurotrophins also have neurotoxic features. One of them brain derived neurotrophic factor (BDNF) upregulates nitric oxide synthase (NOS) activity and thereby counteracts its beneficial action. Inhibiting the production of nitric oxide by applying a free radical scavenger elevates the neuroprotective effects of BDNF treatment.

Intracerebral concentrations of nitric oxide are predominantly regulated by the activity of its producing enzyme, the nitric oxide synthase. A protein inhibitor of nitric oxide synthase (PIN) is able to reduce the amounts of NOS-produced NO. The aim of the present study was to investigate the potential neuroprotective role of PIN in RGCs after axotomy.

Comparison between PIN expression in axotomized and control retina of adult rats was performed using mRNA probes and monoclonal antibodies in order to characterize morphologically retinal distribution of PIN mRNA and protein respectively. The quantitative and temporal translation and expression pattern of PIN was examined by means of semi-quantitative PCR, online PCR, and Western blot. The spatial protein expression of PIN and NOS within the various layers of the retina was shown in colocalization studies.

Both the axotomized retinae (AR) and the control retinae (CR) yield the highest PIN mRNA-levels in both the retinal ganglion cell layer (RGL) and the inner nuclear layer (INL). An elevated PIN mRNA-level in the RGL of the AR, as compared to the CR, is not detectable. Compared to the results of the in situ hybridization, quantitative determination of the mRNA-levels of AR and CR at 6h, 12h, 1d, 3d and 6d after axotomy by PCR display no significant upregulation of the AR PIN expression. Both PIN and neuronal nitric oxide synthase (nNOS) proteins were found in RGC of AR and CR in immunhistological colocalization studies. Western blot experiments do not indicate an enhanced protein level of PIN in the AR. The results of the present study did not confirm an increase of PIN in axotomized retinae neither on the mRNA nor on the protein level.