Arbeiten zur Erythrozyteninvasion von Bartonella tribocorum

Abstract

Bartonellen sind fakultativ intrazelluläre Bakterien, die hämotroph den Menschen und viele Säugetiere besiedeln können. Ein Charakteristikum des Infektionsverhaltens von Bartonella spezies ist die bisher nur für diese Bakterien bekannte Fähigkeit zur Invasion in Erythrozyten. Viele andere intrazellulär auftretende Bakterien invadieren über die Induktion eines endozytotischen Vorgangs in die Wirtszelle, ein Prozeß, für den ein aktives Zytoskelett der Wirtszelle erforderlich ist. Dieses ist beim Erythrozyten nicht vorhanden. Da über den Mechanismus der Erythrozyteninvasion von Bartonella spezies bisher nichts bekannt ist, war ein Beitrag zur Klärung Gegenstand dieser Arbeit. In der vorliegenden Arbeit wurde ein in vivo-Infektionsmodell für einen GFP-tragenden Klon von B. tribocorum 506T (B. tribocorum -gfp) in der Ratte etabliert. Es konnte durch intravenöse Injektion von B. tribocorum-gfp eine klinisch asymptomatische Bakterämie der Versuchstiere erzeugt und eine präbakterämische Initiationsphase, eine bakterämische Expansionsphase sowie die Phase der Persistenz / Elimination beobachtet werden. In der präbakterämischen Phase fanden sich Hinweise für eine spezifische oder unspezifische Akkumulation der injizierten Bakterien in der Leber. Während der bakterämischen Phasen konnte die intraerythrozytäre Lokalisation durch FACS-Analysen und Laser-Scanning-Mikroskopie nachgewiesen werden, so daß das hier etablierte Tiermodell alle Voraussetzungen für die weitere Untersuchung des Invasionsprozesses von B. tribocorum in vivo erfüllt. Die Hypothese, es könne sich bei den primär infizierten Zellen um erythroide Vorläuferzellen handeln, konnte durch Untersuchungen von Knochenmark der Ratten während der Infektion und durch Immunfluoreszensfärbungen und FACS-Analyse der Vorläuferzellen im Blut nicht bestätigt werden. Um Bartonella spezies genetisch manipulieren zu können, wurde ein System zur lokusspezifischen Mutagenese etabliert, welches durch unvollständige Duplikation von Genen erlaubt, Defektmutanten zu generieren. Dazu wurde erstmals ein auf Kanamycin selektionierbares, nicht replikatives Minimalplasmid, pCD394, eingesetzt. Mit diesem System wurden B. tribocorum 506T-Defektmutanten im ialB-Lokus erzeugt, die genetisch stabil und im Ratteninfektionsmodell nicht mehr infektiös waren. Da die durchgeführten Komplementationsversuche nicht zu einer Rekonstitution des phänotypischen Wildtyps führten und die unvollständige Duplikation viele unkontrollierte Folgen im Genom haben kann, bleibt unklar, ob der Verlust der Infektiösität auf der Ausschaltung der Funktion des ialB-Lokus beruht. Ebenso ist nicht klar, ob der in vivo nicht infektiöse Phänotyp aufgrund eines Verlustes der Invasionsfähigkeit in die roten Blutzellen zustande kommt oder ob der Infektionsprozeß an einem anderen Punkt gestört wurde.

The genus Bartonella comprises a group of facultatively intracellular bacteria that hemotropically colonises different mammals including humans. The invasion and colonisation of erythrocytes as hallmark of infection is a feature so far only known for these bacteria. Nothing is known about the invasion process into these host cells. It seems to be fundamentally different compared to invasion employing the endocytotic pathway of nucleated host cells, common for other intracellular bacteria, as this process depends on an active cytoskeleton, which mature red blood cells do not contain. To contribute to the clarification of this question was the aim of this work.

For this purpose, an in vivo rat-animal model was established using a gpf-labeled clone of B. tribocorum 506T (B. tribocorum -gfp). Intravenous injection of B. tribocorum -gfp led to an asymptomatic bacteremia, characterised as a three-step process; the prebacteremic initiation of infection, the bacteremic expansion of infection and the persistence/ elemination of infection. The intraerythrocyteric localisation of B. tribocorum -gfp was demonstrated by FACS-Analysis and confocal microscopy. FACS-Analysis could give evidence for an accumulation of B. tribocorum -gpf in the rat liver during the prebacteremic phase. There was no interaction of B. tribocorum -gfp and erythroid percursor cells, as investigated by immunfluorescence-staining and FACS-Analysis. Thus this animal model is an excellent tool for investigation of the invasion process of B. tribocorum into erythrocytes and colonisation of the natural host.

For locusspecific genetic manipulation of Bartonella spezies the suicid-plasmid pCD394 containing a kanamycin-resistence gene was created and used for mutagenesis of the ialB-locus of B. tribocorum. The resulting strain B. tribocorum Mut#4 was genetically stable and unable to establish an infection in the rat animal model. Complementation of ialB in trans did not lead to reconstitution of the wildtype phenotype. It remains unclear wether the non-infectious properties of the mutant phenotype are caused by loss of ialB-function or other effects and it is not clear at which point the infection process is stopped.