Untersuchungen zur Biokompatibilität von in der Herzchirurgie relevanten Polymerkunststoffen

Abstract

Gegenstand Der Einsatz der extrakorporalen Zirkulation (EKZ, Herz-Lungen-Maschine) ruft über den Kontakt von Blut mit Fremdoberflächen des artifiziellen Kreislaufs (Schlauchsysteme, Oxygenatoren) Reaktionen auf zellulärer Ebene des Blutes hervor. Die Aktivierungen schließen Abwehr-, Gerinnungs- und Signalüber-tragungssysteme ein und erstrecken sich weiter auf den Zellstoffwechsel. Um diese Nebeneffekte zu minimieren, wurden Maßnahmen zur Steigerung der Hämokompatibilität der Systeme ergriffen. Sie umfassen u.a. eine Optimierung der Werkstoffzusammensetzung, sowie Techniken der Beschichtung von Fremdoberflächen mit antikoagulatorischen Substanzen.

Methoden Die vorliegende Arbeit verglich die hämokompatiblen Eigenschaften einer PVC-Oberfläche mit einer heparinbeschichteten PVC-Oberfläche. Es kam ein Modell zum Einsatz, das den Blutfluß entlang einer zu testenden Oberfläche simuliert (ChandlerLoop). Hämokompatibilitätsparameter wurden über ELISA-Techniken, sowie über neu etablierte, durchflußzytometrische Methoden, einschließlich der Flowenzymologie bestimmt. Ziel war neben der Hämokompatibilitätsuntersuchung der Oberflächen, die Etablierung und Evaluation von durchflußzytometrischen Labormethoden. Für die Durchflußzytometrie umfassten die Aktivierungsmarker CD11B/C und CD18/62L, sowie flowenzymologisch intrazellulär die Bestimmung von Kallikrein, Oxidativem Burst, Peroxiden und RGES- / AAPV-Elastasen. Weiterhin wurden Interleukine (IL1b, IL2, TNF-a), das Hitzeschockprotein HSP70, sowie Studien zur Adhäsion von Thrombozyten, Fibrin, Fibrinogen und Leukozyten durchgeführt. Dieser Teil der Analyse wurde von den konventionellen Hämokompatibilitätsmarkern PMN-Elastase, Thrombin-Antithrombin-Komplex (TAT), b-Thromboglobulin, F1+2 Prothrombin, SC5b9-Komplement sowie einer Zellzahlzählung ergänzt.

Ergebnisse Die Heparinbeschichtung verminderte gegenüber unbeschichtetem PVC erfolgreich die Expression von CD11B und CD11C auf Monozyten und Granulozyten, sowie die Abwärts-Regulation von CD18 und CD62. Bei den flowenzymologischen Untersuchungen wurden durchweg stärkere Aktivierungen der Zellen bei Verwendung von unbeschichtetem Material im Simulationsmodell gemessen. Dies betraf in Granulozyten Kallikrein, oxidativen Burst, Peroxiden und AAPV-/RGES-Elastase. Bei den Interleukinen wurden signifikante Anstiege für IL1b und TNF-a detektiert. Die zunehmende Adhäsion von Fibrinogen an Monozyten und Granulozyten bei Verwendung von unbeschichtetem PVC-Material wurde nachgewiesen, ebenso die vermehrte Präsenz des P-Selektin (CD62L) auf Thrombotzyten. Alle konventionellen humoralen Marker erreichten im Vergleich Signifikanzniveau und zeigen die Überlegenheit des heparinbeschichteten Materials.

Bewertung Die Vorteile des heparinbeschichteten Systems gegenüber der unbeschichteten Oberfläche für die Hämokompatibilität konnten anhand einer Reihe der ausgewählten Aktivierungsmarker validiert werden. Die erfolgreiche Etablierung der durchflußzytometrischen Methoden und der konventionellen Bestimmungen über ELISA´s erlaubte eine sichere Reproduzierbarkeit. Die vielversprechenden flow-enzymologischen Untersuchungen geben Anlass zur weiteren Evaluation auf diesem methodischen Gebiet – gleichzeitig wurden die konventionellen Messungen als reliable Kontrollfunktion für andere Methoden erkannt. Durch einen immer grösser werdenden Pool an verfügbaren laborchemischen Methoden werden die Untersuchungsmöglichkeiten für die Hämokompatibilität von Fremdoberflächen in Zukunft weit mehr Ansatzpunkte haben und weitere Erkenntnisse zum Ablauf der Aktivierungs- und Gerinnungspathways beitragen, sowie die Herstellung einer, vom menschlichen Organismus, optimal verträglichen Fremdoberfläche unterstützen.

Subject The application of extracorporal circulation during heart- and lung surgery causes reactions of blood cells initiated by contact with the surface of the used artificial circulation device (eg. tubing, oxygenators). These cell-bound activation processes include cellular defense systems, coagulation and signal transmitting pathways. They also affect cell metabolism. To minimize these side effects, measures have been taken to increase the haemocompatibility of the artificial surfaces. Approaches are optimisations of the composition of the plastic surfaces as well as implementing coating to the surfaces using anticoagulatoric substances. Methods This work compares the haemocompatibility characteristics of a native PVC-surface with a PVC-surface coated with heparin. By using a model, blood flow was simulated alongside the tested surface in vitro (Chandler Loop). Parameters were surveyed by conventional ELISA-techniques and a flowcytometric approach incluing flowencymology. Beside the determination of haemocompatibility aspects concerning the different surfaces, a main objective was the set up of new and reliable methods for flowcytometric detection techniques. Parameters detected by flowcytometry were the activation markers CD11B/C and CD18/62L, intracellular detection of kallikrein, oxidative burst, peroxides, RGES/AAPV-elastases, interleukins IL1beta, IL2, tumor-necrosis factor alpha and heat shock protein HSP 70. This part of the analysis was compared to the conventional haemocompatibility parameters PMN-elastase, thrombin-antithrombin-complex (TAT), beta-thromboglobuline, F1+2-prothrombine, SC5b9-complement and various cell counts. Results The presence of the heparin coating on the surface of the artificial device decreased effectively the expression of CD11B and CD11C on monocytes and granulocytes as well as the down-regulation of CD18 and CD62L on the surface of granulocytes. By using flowcytometric detection an increased cell activation was shown in presence of an uncoated surface. This occurred especially within the granulocyte population when tested for kallikrein, oxidative burst, peroxides and AAPV/RGES-elastases. Focusing on interleukins significant increases were detected for IL1-beta and TNF-alpha when non-coated surfaces were present. Using this surface showed an increased adhesion of fibrinogen to monocytes and granulocytes. Also an increased presence of P-selectin (CD62L) was reported on thrombocytes. All humoral markers measured conventionally proved significance and demonstrated the advantage of the heparin coating. Evaluation The advantages of heparin coating to polymer surfaces could be demonstrated by most of the chosen activation markers. The successful establishment of flowcytometric methods accompanied by long-term reliable conventional humoral markers using ELISA techniques allows a high reproducibility of the tests and conclusions based on them. Especially the flowencymologic results are giving reason for further in depth researches. At the same time it was recognized that the reliability of the humoral markers serves as a good control function for new methodical and technical approaches. With a growing number of laboratory tests available for studies of haemocompatibility new staring points will be at hand for future surveys of biocompatibility. The ultimate aim is the supply of an optimal compatible artificial surface for short- and long-term implantation in the human organism.