Der Einfluss von humanen Serum-DNasen auf den Nachweis von durch Antibiotika abgetöteten E. coli im Blut mittels PCR

Abstract

Die Blutkultur gilt als der Goldstandard zum Nachweis von Bakteriämien bei septischen Krankheitsbildern, hat aber eine deutliche Schwachstelle, da sie bei mit Antibiotika vorbehandelten Patienten oft falsch-negativ ausfällt. Für diesen Fall konnte die spezifische E. coli-PCR bereits ihre Stärke gegenüber der Blutkultur beweisen, da sie in der Lage ist, die Bakterien unabhängig von deren Vermehrungsfähigkeit nachzuweisen. Dennoch könnten im Blut vorhandene DNasen die bakterielle DNA nach Lyse des Bakteriums spalten und so zu einem falsch-negativen PCR-Ergebnis führen. In der vorliegenden Arbeit wurde erstens durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht, welcher Anteil der bakteriellen DNA aus der Bakterienhülle freigesetzt wird, nachdem diese Bakterien durch Antibiotika abgetötet wurden. Der DNA-Verlust betrug nur 14,8% - 28,4%, der größere Teil der DNA blieb vor dem Angriff von im Serum vorhandenen DNasen geschützt in der Bakterienhülle. Zweitens wurde die Bedeutung von DNasen für das Auftreten von falsch-negativen PCR-Ergebnissen überprüft. Es wurden sowohl gereinigte E. coli-DNA als auch durch Antibiotika abgetötete E. coli in Serum mit rekombinanter humaner DNase I in steigender Konzentration inkubiert und anschließend in eine E. coli-spezifische PCR eingesetzt. Der Versuch wurde außerdem in einem Tris-HCl-Puffer an Stelle des Serums durchgeführt, der optimale Bedingungen für die DNase-Aktivität schafft. Das Ergebnis zeigt, dass die freie bakterielle DNA im Serum sehr stabil ist. Erst bei einer Gewichtsrelation der DNA : DNase von 1 : 10.000.000 wurde eine signifikante Abnahme der positiven PCR-Ergebnisse festgestellt. Bei den abgetöteten E. coli konnte die DNase die positiven PCR-Ergebnisse selbst bei einer Gewichtsrelation der DNA : DNase von 1 : 10.000.000.000 nicht signifikant vermindern (p>0,05). Diese Ergebnisse zeigen, dass nach dem Abtöten der Bakterien durch Antibiotika sowohl die Freisetzung der bakteriellen DNA als auch die DNase-Aktivität im Serum zu gering sind, um die Aussagekraft der PCR beim Nachweis von Bakteriämien zu beeinträchtigen.

PCR could be superior to convetional blood culture for diagnosing bacteriaemia in the presence of antibiotics, but even PCR might yield false-negative results if the template DNA were to be cleaved by serum DNAases after antibiotics had induced bacterial death. In this study the release of E. coli DNA after antibiotic-induced bacterial death was quantified and the cleavage of bacterial template DNA by serum DNAases was evaluated by a PCR specific for E. coli. The results indicate that purified E. coli DNA is very stable in human serum; positive PCR results did not decrease significantly until the ratio of recombinant human DNAase : E. coli rose to 10.000.000:1. As only 14,8 – 28,4 % of the total E. coli DNA was released after antibiotic killing, the PCR-based detection of E. coli fell by only 10 % when cefotaxime-killed E. coli were incubated with rhDNAase. It was shown that human serum DNAases and antibiotic killing do not really compromise the realibility of PCR examinations for bacteriaemia.