Einfluss von Botenstoffen auf die freie Calciumkonzentration in reninsezernierenden Zellen von Ratten und Mäusen

Abstract

Das Renin-Angiotensin-Aldosteron System (RAAS) ist neben dem Sympathikotonus das wichtigste Effektorsystem zur Regulation von Blutdruck sowie Salz- und Wasserhaushalt. Die Aktivität des RAAS wird gesteuert über die Sekretionsrate des Renins aus den reninsezernierenden Zellen (RSZ), die ihrerseits von verschiedenen Regulationsmechanismen und einer Vielzahl von Faktoren kontrolliert wird. Zwei entscheidende sekundäre Botenstoffe in diesem System sind cAMP und die freie cytoplasmatische Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i). cAMP wirkt stimulatorisch, [Ca2+]i inhibitorisch auf die Renin-sekretion. Die inverse Verknüpfung zwischen [Ca2+]i und der Renin--sekretionsrate ist für ein sekretorisches System sehr ungewöhnlich („Calciumparadox“). Die RSZ sind lokalisiert in der Media der afferenten Arteriole (AA), nahe dem Eintritt in das Glomerulum. In dieser Arbeit sollte am Modell der isolierten Glomeruli mit anhängender AA aus den Nieren von Ratten und Mäusen die Wirkung verschiedenen Stimuli (Angiotensin II, Adenosin und cAMP) auf [Ca2+]i untersucht werden. Die Änderung von [Ca2+]i wurde im distalen Teil des Gefäßes am Eintritt in das Glomerulum mit Hilfe des Ca2+--sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs Fura-2 gemessen. Im Allgemeinen wurden NaCl-arm ernährte Tiere verwendet, bei denen die Anzahl der RSZ im Vas afferens deutlich erhöht ist. Im ersten Teil der Arbeit wurden die Wirkungen von ANG II und cAMP auf [Ca2+]i untersucht. ANG II, das wichtigste Effektorpeptid des RAAS, erhöhte über Stimulation der AT1-Rezeptoren konzentrationsabhängig [Ca2+]i (EC50 ~ 5 - 10 nM). Gleiches wurde in Adenosin (ADO) A1-Rezeptor knock-out Mäusen und korrespondierenden Wildtypmäusen gefunden. Die Erhöhung des [Ca2+]i konnte in Peak- und Plateauphase untergliedert werden, die auf die Entleerung intrazellulärer Speicher (Peak) und Einstrom von Ca2+ aus dem Extrazellulärraum durch speicheraktivierte Ca2+-Kanäle zurückzuführen waren; spannungsaktivierte Ca2+-Kanäle waren nicht involviert. cAMP-Erhöhung durch verschiedene Stimuli (Forskolin, Isoprenalin, IBMX, Dibutyryl-cAMP) bewirkte ebenfalls eine Erhöhung von [Ca2+]i. Dieses Phänomen, was ebenso an AA aus NaCl-reich ernährten Ratten gefunden wurde, war spezifisch für die AA der Rattenniere, da cAMP-Erhöhung in der AA der Maus und in größeren Gefäßen der Rattenniere basales [Ca2+]i nicht beeinflusste bzw. ein Absinken von bewirkte. Die Erhöhung von [Ca2+]i nach cAMP-Stimulation beruhte zu > 90% auf einen Ca2+-Einstrom von außen durch SOCCs, die sich aber von denen, die bei der Stimulation mit ANG II rekrutiert werden, unterschieden; spannungsaktivierte Ca2+-Kanäle spielten keine Rolle. Dieses unerwartete Phänomen muss nicht unbedingt gegen das „Calciumparadox“ der Reninsekretion sprechen. Die beobachtete Erhöhung von [Ca2+]i war im Mittel kleiner als die, die durch ANG II (3 nM) hervorgerufen wird; zur Hemmung der Reninsekretion könnten stärkere Ca2+-Transienten nötig sein. Im zweiten Teil wurde die Wirkung von ADO auf [Ca2+]i untersucht. ADO stellt über ADO A1-Rezeptoren einen wichtigen Inhibitor der Reninsekretion dar, wobei jedoch die weitere Signalkette dieser Inhibition noch nicht geklärt ist. In den hier vorgestellten Experimenten wurde im wesentlichen der ADO A1-Rezeptor-selektive Agonist N6-Cyclohexyladenosin (CHA, 0,01 - 10 µM) verwendet. Bei der optimalen Konzentration von 1 µM rief CHA in ungefähr 50 % der Fälle einen Anstieg von [Ca2+]i in den RSZ hervor, der 40 ± 11 % der ANG II (3 nM) Antwort betrug. Trotz aller Anstrengung konnte die Variabilität des Effektes nicht vermindert werden. Die Ergebnisse gaben keinen Hinweis darauf, dass ein endogener ADO-Tonus [Ca2+]i in den RSZ moduliert. ADO und ANG II wirken nachgewiesenerweise synergistisch auf die Konstriktion der AA und die Hemmung der Reninsekretion. Bezüglich [Ca2+]i zeigte sich in den Versuchen dieser Arbeit diese Synergie wenn überhaupt, nur sehr schwach; diese Versuche sind in ihrer Aussagekraft durch die Variabilität des CHA-Effektes stark eingeschränkt. Ferner war, die konzentrationsabhängige Erhöhung von [Ca2+]i durch ANG II in AA der ADO A1-Rezeptor-knock-out Maus und der entsprechenden Wildtypmaus nicht voneinander verschieden. Im dritten Teil der Arbeit wurden die Wirkungen von zwei subtyp-selektiven Hemmern der Na+/H+-Austauscher verglichen. Cariporid (NHE1-selektiv) senkte den pH-Wert der RSZ in Ruhe stärker als der neue NHE2-selektive Inhibitor „1522“ (Aventis); „1522“ verzögerte auch die Erholung des pH-Wertes nach Ansäuerung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse darauf hinweisen, dass ADO seine renin-sekretions-hemmende Wirkung nicht durch eine Erhöhung von [Ca2+]i erzielt; der Effekt auf [Ca2+]i war schwach und sehr variabel. Hingegen steigerte der Sekretionsagonist cAMP die [Ca2+]i reproduzierbar. Damit geben diese Ergebnisse keinen Hinweis auf eine zentrale Rolle der [Ca2+]i für Wirkungen von ADO und ß-adrenerger Stimulation auf die Reninsekretion.

The renin-angiotensin-aldosterone-system (RAAS) and sympathetic tone are the most important players in the regulation of blood pressure and of electrolyte and volume homoeostasis. The activity of the RAAS is governed by the aspartyl proteinase renin, which is secreted from the renin secreting (juxtaglomerular) cells (RSC), which are located in the media of the afferent arterioles (AA) close to the entrance into the glomerulus. Renin secretion is controlled by a range of different mechanisms. In this context, two second messengers are of particular importance, i.e. the cytoplasmic free calcium con-centration ([Ca2+]i) and cAMP. Increases in cAMP stimulate and increases in [Ca2+]i inhibit renin secretion. The inverse relationship between the rate of renin release and [Ca2+]i is unusual for exocytotic processes and this anomaly has been termed the “calcium paradox” of renin secretion. In this study, the effect of different stimuli like angiotensin II (ANG II), adenosine (ADO), and cAMP on [Ca2+]i was investigated. Glomeruli with the AA attached were prepared, loaded with FURA-2 and [Ca2+]i was measured from 5-10 cells in the distal region of the AA. In general, kidneys were taken from rats kept on a low NaCl diet, a treatment that increases the number of RSC. Then, the probability that a cell located near the entrance of the AA into the glomerulus was indeed a RSC, was ~80 %. In the first part of this study, the effect of ANG II and of maneuvers that increase cAMP on [Ca2+]i was examined. ANG II increased [Ca2+]i by stimulating ANG II AT1-receptors in a concentration dependent manner (EC50 ~ 5 - 10 nM). The same was found in ADO A1 receptor knock-out and the corresponding wild-type mice. The ANG II-induced Ca2+ increase often showed a peak and plateau phase which were due to Ca2+ mobilization from stores (peak) and Ca2+ influx from the extracellular space (plateau). At [ANG II] = 3 nM, ~45 % of the Ca2+ increase originated from Ca2+ influx, which was essentially due to the opening of store-operated Ca2+ channels (SOCCs); voltage-dependent Ca2+ channels were not involved. Increases in cAMP by forskolin, isoprenaline, isobutyl-methyl-xanthine or application of dibutyryl-cAMP induced a Ca2+ transient in many preparations. This response, which was also found in AA from rats on high NaCl diet, was specific for rat RSC since it was not observed in larger arteries from rat kidney nor in mouse AA. >90 % of the Ca2+ for the response in rat RSC came from Ca2+ influx through SOCCs. These SOCCs showed pharmacological properties which differed from those of the SOCCs activated by ANG II. This unexpected phenomenon does not necessarily contradict the „calcium paradox”. The Ca2+ transient in response to cAMP was generally smaller than that to ANG II (3nM) and may be smaller than the Ca2+ increase required to inhibit renin secretion. In the second part the influence of adenosine (ADO) on [Ca2+]i was investigated. ADO is a well known inhibitor of renin secretion; however the mechanism of this inhibition is not yet known. In most experiments, the A1 receptor agonist N6-cyclohexyladenosine (CHA, 0.01-10 µM) was used which gave better results than ADO. CHA affected the number of responding arterioles and [Ca2+]i with a bell-shaped concentration dependence. Best effects were observed at 1 µM CHA where ~50 % of the vessels responded and the [Ca2+]i increase in the responding arterioles was 40 ± 11 % of that produced by ANG II (3 nM). Efforts to reduce the variability of this response were unsuccessful. No evidence for an effect of endogenous ADO on [Ca2+]i was found in this preparation. Due to this variability, the well known functional synergism of ADO and ANG II could not be convincingly demonstrated on the [Ca2+]i level. If the two hormones synergistically increase [Ca2+]i in RSC, the synergy must be small. In addition and as mentioned above, the concentration dependent increase in [Ca2+]i induced by ANG II is the same in AA from ADO-A1 receptor knock out and wild-type mice. In the last part, the effects of two subtype-selective inhibitors of Na+/H+-exchangers (NHEs) on intracellular pH were examined. Cariporide (NHE1-selective) decreased pH in RSC more than „1522” (NHE2-selective, Aventis). In addition , „1522”delayed the recovery of pHi after acidification. In summary, the experiments show that ADO A1 receptor stimulation increased [Ca2+]i in RSC in some but not all cases and that the effect was small. This suggests that an increase in [Ca2+]i is not the major mechanism by which ADO inhibits renin secretion. On the other hand, cAMP increased [Ca2+]i in a reproducible manner; this effect is not easily reconciled with the calcium paradox of renin secretion. Hence the results of this study do not support a central role of [Ca2+]i for the effects of ADO and ß-adrenergic stimulation on renin secretion.