Phagozytose-assoziierte Rezeptoren bei der Legionellen-Pathogenese

Abstract

Legionella pneumophila ist ein Bakterium, das beim Menschen zu lebensbedrohlichen Pneumonien führen kann. Als zentraler Pathomechanismus wird die Fähigkeit zur intrazellulären Vermehrung angesehen. Obwohl in der Vergangenheit Komplementrezeptoren als ein Weg der Legionellen in menschliche Monozyten/Makrophagen beschrieben wurden, ist bis heute völlig unklar, in welchem Ausmaß diese Rezeptoren zur Adhärenz und Phagozytose beitragen. In der vorliegenden Arbeit sollten neben den Komplementrezeptoren 1 und 3 weitere Oberflächenmoleküle auf ihre Beteiligung bei der Aufnahme von L. pneumophila untersucht werden. In einem ersten Versuch wurde zunächst die Phagozytose und intrazelluläre Vermehrung der Legionellen in einer Monozyten-Zellinie bestätigt. Als Bakterien wurden in allen Untersuchungen die Wirtszell-adaptierte L. pneumophila Sg1 (frisches Patientenisolat, Lp1v) und die Agar-adaptierte L. pneumophila Sg1 ATCC 33152 (Lp1a) eingesetzt. Bei der Zellinie handelt es sich um die sehr weit differenzierte Monozyten-Linie Mono Mac 6. Diese Versuche wurden anschließend mit HeLa- und Jurkat-Zellen, die sich beide in ihrem Oberflächenrezeptor-Repertoire vor allem hinsichtlich der Komplementrezeptoren von Mono Mac 6 unterscheiden, wiederholt. Auch von diesen Zellen wurden die Legionellen in gleichem Ausmaß phagozytiert, eine intrazelluläre Vermehrung in nenneswertem Ausmaß fand jedoch nicht statt. Für den Hauptteil der Arbeit wurden den Ansätzen 30 Minuten vor Beginn der Infektion von Mono Mac 6 mit Legionellen blockierende monoklonale Antikörper oder irrelevante Isotypenkontrollen zugegeben. Dabei wurden die folgenden Oberflächenrezeptoren untersucht: Die Komplementrezeptoren 1 (CD35) und 3 (CD11b/CD18), der LPS-Rezeptor (CD14), die ß-Integrinkette des Fibronectin-Rezeptors (CD29), das interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1, CD54) und der Transferrinrezeptor (CD71). Die Oberflächenexpression dieser Rezeptoren wurde vor Beginn der Versuchsreihen durchflußzytometrisch ermittelt. Komplementrezeptor 1 (CD35) war als einziger praktisch nicht nachweisbar, alle anderen Oberflächenmoleküle waren, abhängig vom Klon, auf mindestens drei Viertel aller Zellen vorhanden.

In allen Untersuchungen fanden sich, wie zu erwarten war, signifikante Veränderungen der Phagozytoserate zwischen dem Wirtszell-adaptierten, virulenten und dem Agar-adaptierten, attenuierten Stamm: Von L. pneumophila Sg1 (Lp1v) fanden sich durchgehend 1 bis 2 Zehnerpotenzen mehr Colony Forming Units (CFU) /ml. Zwischen den Ansätzen mit monoklonalen Antikörpern und denjenigen ohne bzw. mit irrelevanten Antikörpern ließen sich jedoch keinerlei Unterschiede in der Phagozytoserate feststellen. Dies bedeutet, dass sich die Phagozytose der verwendeten Legionellen durch die Mono Mac 6-Zellen mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern nicht verhindern ließ. Hierfür gibt es zwei mögliche Erklärungen: Entweder blockierten die funktionsinhibierenden Antikörper nicht die Bindungsstelle der Bakterien oder die Legionellen gelangen über andere Rezeptoren in die Monozyten. Zu diskutieren sind hier neben dem Mannoserezeptor Hitzeschockprotein-, Lektin- oder noch völlig unbekannte Rezeptorsysteme.

Legionella pneumophila is a bacterium causing fatal pneumonia in humans. The ability to multiply intracellularly is widely accepted as the central pathomechanism. Although complement receptors have been described as a way of Legionella spp. to enter monocytes and macrophages, it remains unclear to what extent these receptors contribute to adhesion and phagocytosis. The role of complement receptors (CR) 1 and 3 and several other surface proteins in the uptake of L. pneumophila has been studied. In a first experiment, phagocytosis and intracellular multiplication of host cell-adapted L. pneumophila serogroup (Sg) 1 (fresh patient isolate, Lp1v) and agar-adapted L. pneumophila Sg 1 ATCC 33152 (Lp1a) in the highly differentiated monocytic cell line Mono Mac 6 (MM6) were verified. These tests were repeated with HeLa and Jurkat cells that differ much from MM6 cells regarding their surface receptors and particularly their complement receptors. Bacteria were ingested to the same extent by HeLa and Jurkat cells, but didn’t multiply intracellularly. In another series, the expression of cell surface receptors such as complement receptors 1 (CD35) and 3 (CD11b/18), the lipopolysaccharide (LPS)-receptor (CD14), the ß1-integrin chain of the fibronectin receptor (CD29), the intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1, CD54) and the transferrin-receptor (CD71) on MM6 cells was verified by means of flow cytometry. All receptors were expressed on at least 75% of the tested cells except CR1 (CD35) which was not detected at all.

In order to assess the role of these receptors in phagocytosis, they were blocked by specific monoclonal antibodies or irrelevant isotype controls before infection. As expected, significant differences in phagocytosis were found between the virulent Lp1v and the agar-attenuated Lp1a: The virulent strain was phagocytized more frequently. No significant changes could be found between the control and the MM6 cells incubated with either blocking monoclonal antibodies or irrelevant isotype controls. In summary, phagocytosis of the tested Legionella spp. could not be inhibited by monoclonal antibodies. There are two possible explanations: Either the inhibiting antibodies did not block the bacterial binding sites or Legionella spp. use different receptors to enter their host cells, such as the mannose-, heat shock protein-, lectin or yet to be described receptor systems.