Regenerationsverhalten humaner Skelettmuskulatur bei neurogenen und myopathischen Muskelerkrankungen

Abstract

Für die Regeneration menschlicher Skelettmuskulatur sind die Satellitenzellen verantwortlich. Sie stellen eine ruhende Population an Zellen dar, die sich während der Myogenese von den Myoblasten trennt und ihre charakteristische Position an den Muskelfasern zwischen Plasma- und Basalmembran einnimmt. Nach Aktivierung kehren sie in den Zellzyklus zurück und sind in der Lage neue Muskelfasern zu bilden. In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Studien durchgeführt, die sich mit Aktivierung und Funktion dieser Zellen vorwiegend bei Tieren beschäftigten. Die Muskeltranskriptionsfaktoren der MyoD-Familie, vor allem MyoD1 und Myogenin, spielen in der Determinierungs- und Differenzierungsphase der aktivierten Satellitenzellen eine wichtige Rolle. Bisher ist noch wenig über Satellitenzellen in humaner Muskulatur bekannt. Diese Studie beschäftigte sich damit, unter Einbeziehung der tierexperimentell gewonnenen Ergebnisse, den Ablauf und die Stärke der Regeneration bei verschiedenen Erkrankungen zu vergleichen. Muskelbiopsien von vier Patienten, die an einer Muskeldystrophie vom Typ Duchenne (DMD) erkrankt sind, fünf Patienten mit anderen Muskeldystrophien (andere Dystrophien), elf Patienten, die an einer neurogenen Muskelatrophie leiden und vier Patienten ohne Hinweise auf eine Muskelerkrankung wurden untersucht. Immunhistochemische Färbungen der angefertigten Kryostatschnitte wurden auf die Häufigkeit angefärbter Zellen bzw. Zellkerne pro Muskelfaser ausgewertet. Die Gesamtzahl an Satellitenzellen wurde mit einem Antikörper gegen das Neural cell adhesion molecule (N-CAM) markiert. Aktivierte Zellen lassen sich mit Antikörpern gegen die Proteine MyoD1 und Myogenin nachweisen. Um neu gebildete Fasern zu kennzeichnen wurde jeweils ein Schnitt mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt. Diese Fasern färben sich dabei, entsprechend ihrem RNA-Reichtum, basophil an. Die Häufigkeit dieser basophilen Fasern bezogen auf alle Fasern beschreibt die abgelaufenen Regenerationsarbeit in den vergangenen Wochen. Der Antikörper gegen N-CAM markiert sowohl ruhende als auch aktivierte Satellitenzellen. Somit stellen die N-CAM-positiven Satellitenzellen (N-CAM+) ein Art Grundpopulation dar. Die Häufigkeit an N-CAM+ Zellen zeigte keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Erkrankungsgruppen, wie es auch in anderen Studien beschrieben wurde. Aktivierte Satellitenzellen oder Muskelfaserkerne färben sich mit Antikörpern gegen die Muskeltranskriptionsfaktoren MyoD1 (MyoD1+) oder Myogenin (Myogenin+). Studien auf mRNA Ebene zeigen, dass MyoD1 im Determinierungsstadium der Satellitenzellen exprimiert wird. Myogenin hat eine Funktion bei der Differenzierung von Satellitenzellen und deren Fusion zu Myotuben. MyoD1+ oder Myogenin+ Zellen waren in sämtlichen Diagnosegruppen und in der Kontrollgruppe zu finden. In den Gruppen der DMD und anderen Dystrophien ließen sich signifikant mehr aktivierte Zellen darstellen als in der Kontrollgruppe. Regeneration, entsprechend basophiler Fasern, zeigte sich im Wesentlichen nur bei der DMD und anderen Dystrophien. Dies bedeutet, die erhöhte Zahl an aktivierten Zellen in diesen Gruppen präsentiert Regeneration. Darauf weisen auch zentrale Kerne und Muskelfasern, die mehrere gefärbte Kerne zeigen, hin. Da bei diesen Gruppen die Anzahl MyoD1+ und Myogenin+ Zellen teilweise die Masse der N-CAM+ Satellitenzellen übertrifft muss angenommen werden, dass es sich dabei teilweise um Muskelfaserkerne handelt. Die Zellkerne, die sich bei den neurogenen Atrophien und den normalen Biopsien mit den Antikörpern gegen MyoD1 und Myogenin anfärben lassen, haben entweder die Expression der Proteine erworben oder sind Kerne, die aktiviert wurden, ohne direkte Regenerationsarbeit zu leisten. Dies widerspricht der Annahme einer durch Denervierung stimulierten Myogenese.

Regeneration of human skeletal muscle strongly depends on the presence of so called satellite cells. These are quiescent cells, which separate from the myoblasts during myogenesis and take up a characteristic localisation beneath plasma membrane and a basal lamina. Upon activation they enter the cell cycle and become able to build new muscle fibres. Lately many studies have dealt with activation and function of satellite cells, mainly in animal models. It is known, that members of the MyoD-family (a family of muscular transcription factors), namely MyoD1 and myogenin, play an important role in specification and differentiation of active satellite cells. Nevertheless so far only little is known about human satellite cells. In this study we evaluate the progression and ability of regeneration in different human muscle diseases, taking into account the results of recent animal studies. We compared muscle biopsies of four patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD), five patients with other muscular dystrophies (other dystrophies), eleven patients with neurogenic muscle atrophy and four patients without any sign of muscle disease. Cryostat sections were tested immunohistochemically for the frequency of stained cells or nuclei per muscle fibre. The entirety of satellite cells was stained by an antibody against the neural cell adhesion molecule (N-CAM). Activated cells were stained with antibodies against the proteins MyoD1 or myogenin. To detect newly formed muscle fibres we applied a haematoxilin/eosin (HE) dye. Newly formed muscle fibres become basophilic due to their RNA content. The frequency of basophilic fibres corresponds to the regeneration that has taken place during the preceding weeks. The antibody against N-CAM recognizes as well quiescent as activated satellite cells. Thus N-CAM expressing cells (N-CAM+) represent the basic population of satellite cells. As described previously, there was no difference between the various muscle diseases regarding the frequency of N-CAM+ cells. Activated satellite cells were stained with antibodies against the muscle transcription factors MyoD1 (MyoD1+) or myogenin (Myogenin+). Studies of the mRNA-level showed, that MyoD1 is expressed upon activation of satellite cells. Myogenin is involved in the process of differentiation of satellite cells and their fusion to myotubes. MyoD1+ or Myogenin+ cells could be found in all kinds of diseased muscle as well as in normal muscle controls. In the sections of DMD and other dystrophies, activated cells are significantly increased in number compared to control sections. Basophilic fibres indicating regenerative activity could only be found in muscles of DMD and other dystrophies. This clearly means, that the elevated number of activated cells in these muscles refers to genuine regeneration. This is confirmed by the finding of cells containing a central nucleus or multiple nuclei. Due to the higher amount of MyoD1+ and Myogenin+ cells compared to N-CAM+ satellite cells, the observed nuclei inevitably partly belong to muscle fibres. Nuclei in biopsies of neurogenic muscle atrophy or normal muscle that are stained by MyoD or myogenin antibodies, have either acquired the expression of these proteins or are activated without participating in muscle cell regeneration. These results contradict the assumption of stimulation of myogenesis by denervation.