Telomerbiologische Untersuchungen zum zellulären Umsatz hämatopoetischer Stammzellen nach haploidenter Transplantation mit hoher Dosis an Stammzellen

Abstract

Telomere sind die Enden aller linearen eukaryotischer Chromosomen, welche aus repetitiven DNA-Sequenzen bestehen. Die Funktion der Telomere besteht im Schutz der Chromosomenenden vor Degradation, Fusion und Rekombination. In den meisten somatischen Zellen verkürzen sich die Telomere mit jedem Zellzyklus. Dieser Verlust an telomeren DNA-Sequenzen, bei allen Vertebraten T2AG3, kann als mitotische Uhr aufgefasst werden, mit der eine Zelle die Anzahl der Zellteilungen zählt und Lebensspanne und Zellalterung dirigiert. Messungen der Telomerlängen in peripheren Blutzellen mit kurzer Lebensdauer, wie zum Beispiel Granulozyten und Monozyten, können als Surrogatmarker für den Umsatz an hämatopoetischen Stammzellen während der physiologischen Hämatopoese, aber auch nach Stammzelltransplantation dienen. Frühere Studien konnten zeigten, dass das Verkürzen der Telomere auf das erste Jahr nach Transplantation beschränkt ist. Für die vorliegende Arbeit wurde eine Kombination aus quantitativer Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Durchflußzytometrie, die sogenannte Flow-FISH Methode, verwendet, um Lymphozyten und myeloische Zellen von Empfängern und ihren jeweiligen Spendern nach allogen-haploidenter Megadose-Stammzelltransplantation zu analysieren. Es sollte auch untersucht werden, welche Auswirkung die Anzahl an transplantierten Stammzellen auf die Telomerverkürzung nach Transplantation hat. Es wurden mononukleäre Zellen und periphere Blutleukozyten von insgesamt zwei adulten und fünfzehn pädiatrischen Empfänger-Spender-Pärchen zwischen dem 28. und dem 1487. Tag nach Transplantation untersucht (Durchschnitt Tag 434 nach Transplantation). Die transplantierte Zellzahl an CD34+ Stammzellen pro Kilogramm Körpergewicht lag im Bereich zwischen 0,4 und 4 x 107 Zellen und die durchschnittlich transplantierte Zellzahl betrug 2 x 107 Zellen. Zwei Patienten mussten aufgrund ihres inkompletten Chimerismus (< 95%) von weiteren Analysen ausgeschlossen werden. Die Ergebnisse wurden als Differenz zwischen Spender und Empfänger (delta Tel) sowohl für myeloische Zellen als auch für Lymphozyten in „Molecular equivalents of soluble fluorochrome“ (kMESF) ausgedrückt. Für myeloische Zellen wurde eine durchschnittliche Verkürzung der Telomere um 0,9 + 0,5 kMESF (Durchschnitt + S.E.) gemessen. Dies entspricht fünf bis zehn zusätzlichen Zellteilungen im Empfänger nach Transplantation. Selbst für Patienten, welche in sehr jungen Jahren transplantiert wurden, sollte sich allein aus der Telomerverkürzung post transplantationem keine Erhöhung des Risikos der Entstehung von Sekundärmalignomen, wie z.B. Myelodysplasien, ergeben. Überraschenderweise konnte bei drei Empfängern eine Verlängerung ihrer Telomere in myeloischen Zellen gegenüber ihren jeweiligen Spendern nach Transplantation detektiert werden. Dies ist mit der Theorie der „clonal succesion“ nach Kay erklärbar: Die Telomerlänge peripherer Zellen ist von der replikativen Vorgeschichte der gerade zur Hämatopoese beitragenden, aktiven Stammzelle abhängig. Keine signifikante Korrelation konnte zwischen dem Maß an Telomerverkürzung in myeloischen Zellen und der Anzahl an transplantierten CD34+ Stammzellen beobachtet werden. Diese Tatsache deutet daraufhin, dass die Zahl der nach Transplantation zur Hämatopoese beitragenden Stammzellen nicht nur durch die transplantierten CD34+ Zellen geprägt ist, sondern auch durch Gegebenheiten im Empfänger selbst, wie zum Beispiel Anzahl der zur Verfügung stehenden Stammzellnischen, Immunphänomene und/oder andere noch unbekannte Einflussgrößen. Die Verkürzung der Telomere in Lymphozyten der Empfänger gegenüber ihren Spendern war sehr heterogen (1,3 + 0,6 kMESF). Diese Beobachtung könnte das Resultat der verschiedenen Zeitpunkte der Untersuchungen nach Transplantation sein, da je nach Zeitpunkt unterschiedliche Lymphozytensubpopulationen zum peripheren Lymphozytenpool beitragen. Künftige Studien nach Transplantation werden eine separate Analyse der Telomerlängen in phänotypisch definierten Leukozytensubpopulationen (z.B. naive und memory T-Helferzellen (CD4+) sowie zytotoxische (Killer) T-Zellen (CD8+)) zum Ziel haben. Hierzu kann die Flow-FISH Methode mit Oberflächenmarkierungen kombiniert werden, die Vorarbeiten zu dieser neuen Methodik werden im Rahmen dieser Arbeit bereits beschrieben.

Telomeres are specialized structures at the end of eukaryotic chromosomes that consist of hundreds to thousands of tandem repeats of the sequence TTAGGG in vertebrats. Telomeres guarantee chromosome integrity by preventing illegitimate recombination, degradation and end fusions. Because somatic cells have a limited lifespan and their telomeres shorten with every cell cycle, it has been postulated that telomeres function as a mitotic clock and that telomere length represents remaining replicative potential. Telomere length measurements in short lived peripheral blood myeloid cells (i.e. granulocytes and monocytes) can be used as a surrogate marker for hematopoietic stem cell turnover in normal hematopoiesis and after allogeneic stem cell transplantation (SCT). Previous studies have shown that telomere shortening was restricted to the first year post SCT. In the current study, quantitative fluorescence in situ hybridisation and flow cytometry (Flow-FISH) was used to analyse lymphocytes and myeloid cells from recipients and their respective donors after haploidentical megadose SCT in order to investigate the role of the infused stem cell dose on the degree of telomere reduction post transplantation. In total, mononuclear cells (MNC) and peripheral blood leucocytes (PBL) from 2 adult and 15 pediatric recipient-donor pairs were analysed at an average of 434 days (range: 28 – 1487) post transplant. The number of transplanted CD34+ cells per kg body weight ranged from 0,4 to 4,0 x 107 (mean 2 x 107). Two patients had to be excluded from analysis due to incomplete chimerism (<95% donor cells). Results were expressed in “molecular equivalents of soluble fluorochrome“ (MESF) units as the difference between donor and recipient (delta Tel) both for myeloid cells and total lymphocytes. For myeloid cells an average telomere shortening of 0,9 + 0,5 (mean + S.E.) kMESF was detected. So transplanted hematopoietic stem cells (HSCs) would theoretically undergo 5 to 10 extra divisions after transplant in recipient. Even for patients who have been transplanted in their childhood, there will be no elevated risk for secondary malignancies (e.g. acute leukemia and myelodysplastic syndromes). Interestingly, after SCT telomere length in myeloid cells of 3 recipients was found to be elongated compared to their respective donors. This observation could be explained by Kay´s theory of “clonal succession”: the length of telomeres of peripheral blood cells depends of the replicative history of the active stem cell, that is actually contributing to steady-state or stressed hematopoiesis. No significant correlation between telomere shortening (delta Tel myeloid) and the number of infused CD34+ cells was observed. These data suggest that the number of HSC actively contributing to hematopoietic recovery after haploidentical megadose SCT is not restricted to the number of transplanted CD34+ cells but also to recipient parameters, e.g. number of stem cell niches available, immune phenomena and/or other factors. The telomere shortening in lymphocytes was variable (1,3 + 0,6 kMESF), probably reflecting the contribution of different lymphocytes to the peripheral blood lymphocyte pool at different points in time post SCT. Future studies will aim at a separate analysis of telomere length in phenotypically defined leukocyte subpopultions (e.g. naïve and memory cells) post SCT by combining Flow-FISH with cell surface staining: the Multi-Color Flow-FISH.