Untersuchung genetischer Aberrationen am duktal invasiven Mammakarzinom mittels Laser Capture Microdissection (LCM) und Comparativer Genomischer Hybridisierung - Etablierung einer neuen Methode

Abstract

Das Mammakarzinom ist der häufigste maligne Tumor der Frau. Die Kenntnis der molekulargenetischen Pathogenese und Tumorprogression ist für eine verbesserte Diagnostik mit dem Ziel einer effektiven, individualisierten Therapie von elementarer Bedeutung. So ist die Mutation des Onkogens HER/2neu Zeichen einer aggressiven Tumorform, die durch Therapie mit monoklonalen Antikörpern bereits günstig beeinflusst werden kann. Entsprechend könnten spezifische genetische Aberrationen für verschiedene Progressionsstadien ein Schritt in Richtung eines Tumorprogressions-modells ähnlich dem des kolorektalen Karzinoms sein. Zur genauen Untersuchung des Tumorgenoms eignen sich differentielle DNA-Analysen wie die Comparative Geno-mische Hybridisierung (CGH). Exakte Analysen setzen einen hohen Reinheitsgrad der zu untersuchenden Tumor-DNA voraus. Da Tumorzellen in heterogenem Gewebe liegen, sind zum Erhalt reiner Tumor-DNA besondere Mikrodissektionstechniken erforderlich. In der vorliegenden Arbeit wurde hierfür die neuartige Technik der Laser Capture Microdissection (LCM) eingesetzt. Diese wurde mit einer DOP-PCR (PCR mit degenerierten Primern zur Amplifikation des kompletten Genoms) kombiniert, um so aus den sehr homogenen, aber geringen nach Mikrodissektion erhaltenen DNA-Mengen eine ausreichende DNA-Konzentration für nachfolgende CGH-Experimente zu erhalten. In der vorliegenden Arbeit wird die Etablierung und Optimierung der Einzelmethoden LCM, DOP-PCR und CGH sowie deren Kombination vorgestellt. Zwei Primärtumoren sowie eine Lymphknotenmetastase von duktal invasivem Mammakarzinom wurden intensiv untersucht und es wurden mit Literaturangaben übereinstimmende Aberratio-nen gefunden. Damit konnte die Eignung der eingesetzten Methoden für die zytogenetische Analyse des Mammakarzinoms gezeigt und die Grundlage für breit angelegte Studien zu dessen Entstehung und Progression geschaffen werden.

Breast cancer is the most frequent malignant neoplasia in women. The understanding of its genetic pathogenesis and progression during tumor growth is of essential importance for an improved diagnostic procedure with the aim of an effective and individualised therapy. Mutations of the oncogene HER/2neu, for example, indicate an aggressive tumor form, which can be favourably influenced by a treatment with monoclonal antibodies. In the same way, specific genetic aberrations for different stages of progression could be a step towards a tumor progression model similar to the one existing for colorectal cancer. Differential DNA-analysis like Comparative Genomic Hybridization (CGH) is a suitable tool for the exact investigation of the tumor-genome. This requires a high grade of purity of the extracted tumor-DNA. As tumor cells are embedded in heterogeneous tissue, special microdissection technologies are necessary to obtain pure tumor-DNA. Therefore, in the work presented here the new technology of Laser Capture Microdissection (LCM) was used. This technology was combined with a DOP-PCR (PCR with degenerated primers for amplification of the complete genome) in order to obtain sufficient concentrations of DNA for subsequent CGH-experiments. This thesis presents the establishment and optimizing steps of the separate methods LCM, DOP-PCR and CGH as well as their combination. Two primary cancers as well as one lymph node metastasis of invasive ductal breast cancer were intensively analysed and aberrations known from the literature could be confirmed. This shows the suitability of the chosen methods for cytogenetic analysis of breast cancer and provides an important basis for broad studies of genetic progression of breast cancer.