Untersuchungen zur Methodik der immunhistochemischen Darstellung von Synapsen beim Morbus Hirschsprung und der Intestinalen Neuronalen Dysplasie

Abstract

Der Nachweis von Morbus Hirschsprung und verwandten Störungen mit der Acetylcholinesterase-Reaktion ist v.a. bei der Intestinalen Neuronalen Dysplasie (IND) mit Unsicherheiten behaftet. Immunhisto­chemische Methoden könnten hier zusätzliche Informationen bringen. In den vorgestellten Untersuchungen wurden in Kryostatschnitten Synapsen in der Ring- und Längsmuskulatur des Kolons bei Morbus Hirschsprung, IND und gesunden Proben mit einem polyklonalen Konjugatantikörper gegen Synaptophysin (EPOS, DAKO®) dargestellt. Fläche und Anzahl der Antikörper-Markierungen wurden mit einem digitalen Bildanalysesystem (Quantimet 600) quantitativ erfasst und mittels deskriptiver Varianzanalyse die Auswirkung verschiedener Einflussgrößen auf das Ergebnis der Messungen untersucht. Es sollte geprüft werden, ob das Verfahren für die differenzierende Darstellung von Synapsen beim Morbus Hirschsprung und der IND geeignet ist. Für die Art der Innervationsstörung (Aganglionär, Dysplastisch bzw. Gesund) konnte kein signifikanter Einfluss auf Fläche und Anzahl der Antikörper-Markierungen nachgewiesen werden. Dagegen wurde das Messergebnis signifikant bestimmt durch weitere Einflussgrößen. Diese waren der Ort der Messung (Ring- oder Längsmuskulatur ohne (Lokalisation) bzw. mit Berücksichtigung der Innervationsstörung (Lokalisation*Erkrankung)), die Richtung, in der die Fasern in der Biopsie angeschnitten waren (Schnittrichtung) und die jeweilige Einzelprobe mit definierter Innervationsstörung (Probe[Erkrankung]). Vorausgesetzt, dass zweifelsfrei Synapsen markiert wurden, ist die Methode geeignet, diese darzustellen und mit der digitalen Bildanalyse zu registrieren. Differentialdiagnostische Aussagen sind mit den bisher vorgestellten Untersuchungen und nach dem Wissen aus Vorarbeiten mit immunhistochemischen Methoden bislang nicht möglich.

Diagnosis of Hirschsprung's disease and allied disorders using acetylcholinesterase reaction is not yet sure especially in Intestinal Neuronal Dysplasia (IND). Immunohisto­chemical methods could bring further information. In the presented investigations synapses of the circular and longitudinal muscle layer of bowel with Hirschsprung's disease, IND and regular innervation pattern were labeled with a polyclonal conjugated antibody against synaptophysin (EPOS, DAKO®) on cryostat sections. Area and number of antibody staining were registered quantitatively with digital image analysing system (Quantimet 600) and different effects on measurement results examined using descriptive analysis of variance. It should be examined if these procedure could be applied to make a precise distinguishing marking of synapses in Hirschsprung's disease and IND. Regarding the type of innervation disorder (aganglionic, dysplastic or regular) no significant effect on area and number of antibody staining could be demonstrated. However measuring results were significantly influenced by further effects. These were place of registration (circular or longitudinal muscle layer without (localization) or with consideration of innervation disorder (lokalization*disorder)), direction of cutting the fibers in the biopsy (cut) and specimen each with its defined innervation disorder (specimen[disorder]). Provided that there were synapses stained beyond doubt, the method can be applied to mark and register them by using digital image analysing system. Differential diagnostic statements can not yet be made by using immunohistochemical staining methods according to the investigations presented until now and knowledge from prior studies.