Pharmakologische und kinetische Analyse der Mikroautophagocytose in vitro

Abstract

Die Messung der Mikroautophagocytose in vitro dient als Modellsystem für das Abschnüren von Vesikeln auf der luminalen Seite von Zellorganellen. In dieser Arbeit konnten mehrere Inhibitoren dieser Reaktion gefunden werden: Latrunculin A, Cytochalasin B, Cytochalasin D, Twinfilin, Nystatin, Amphotericin B, FCCP, Valinomycin, GTP(S, Aristolochiasäure, K252a, Rapamycin. Die Identifizierung dieser Inhibitoren ergab Hinweise auf an der Mikroautophagocytose beteiligte Komponenten. Dazu zählen Actin, Ergosterol, das vakuoläre Membranpotential, G-Proteine, Phospholipasen + Proteinkinasen. Antikörper gegen Aut1p, Apg5p, Apg6p, Apg10p und Apg16p wurden hergestellt + ihre Wirkung auf die Mikroautophagocytose in vitro untersucht. Keiner dieser Antikörper konnte diese Reaktion inhibieren, was auf Unterschiede der molekularen Mechanismen von Makro- und Mikroautophagocytose hindeutet. Das Verhalten von Actin im Verlauf der Mikroautophagocytose wurde in vitro biochemisch und in vivo fluoreszenz- sowie elektronenmikroskopisch untersucht; es bindet an Vakuolen + reichert sich an der Membran autophagischer Körperchen an. Mit Hilfe der genannten niedermolekularen Inhibitoren der Mikroautophagocytose wurde die in vitro-Reaktion in vier Stadien aufgeteilt. Die letzte dieser Stufen, ein Zustand, in dem die Vakuolen kompetent für eine schnelle + auch bei tiefen Temperaturen ablaufende Aufnahme des umgebenden Mediums sind, kann nur erreicht werde, wenn die vorhergehenden Stadien durchlaufen wurden. Da die für die einzelnen Stufen spezifischen Hemmstoffe bekannte Zielstrukturen angreifen, konnten den kinetisch definierten Stadien molekulare Ereignisse zugeordnet werden. Die erhaltenen Ergebnisse geben nicht nur Aufschluß über eine grundlegende zelluläre Reaktion, sondern zeigen auch, wie diese pharmakologisch beeinflußt werden kann. Dies könnte von Bedeutung sein für die Suche nach Antimykotika, aber auch nach Medikamenten zur Behandlung von Stoffwechsel- + Autoimmunerkrankungen.

Microautophagy in vitro can serve as a model system for vesicle scission inside the lumen of an organelle. In this work, several inhibitors of this reaction were identified: latrunculin A, cytochalasin B, cytochalasin D, twinfilin, nystatin, amphotericin B, FCCP, valinomycin, GTP(S, aristolochic acid, K252a, rapamycin. The identification of these inhibitors gives hints on components being involved in microautophagy. Among those are actin, ergosterol. the vacuolar membrane potential, G-proteins, phospholipases and protein kinases. Antibodies directed against Aut1p, Apg5p, Apg6p, Apg10p and Apg16p were raised and their action on microautophagy in vitro was assayed. None of these antibodies was able to inhibit this reaction, indicating there may be differences in the molecular mechanisms of macro- and microautophagy. The behaviour of actin in the course of microautophagy was examined biochemically in vitro and by means of fluorescence- and immunoelectron microscopy in vivo. Actin binds to vacuoles and is enriched on autophagic bodies. Using the low molecular weight inhibitors mentioned above, microautophagy could be dissected in vitro into 4 stages. The latest of these stages, a state, in which vacuoles are competent for rapid uptake of the surrounding medium even at low temperatures, can only be reached if all of the preceeding stages have been completed. As the targets of inhibitors selectively blocking a specific stage of reaction are known, molecular events can be assigned to kinetically defined stages. The results of this work do not only shed some light on a basic cellular reaction, but show as well how this reaction can be influenced pharmacologically. This can help in the search for antimycotica, but also for drugs influencing metabolic and autoimmune disease.