Inhaltszusammenfassung:
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das Bindungsverhalten der
Radioliganden 3H-P1075 (Kaliumkanalöffner) und 3H-Glibenclamid
(3H-GBC, Kanalschliesser) an Membranen von A10- Zellen (glatte
Muskelzellen aus der embryonalen Rattenaorta) als Modell des
vaskulären ATP- abhängigen K+-Kanals (KATP) untersucht und mit
früheren Studien an intakten Zellen verglichen. Dabei konnte die dort
gefundene eine Öffnerbindungsstelle für P1075 an A10-Zellmembranen auf
dem Sulfonylharnstoffrezeptor SUR2B, der ß-Untereinheit des vaskulären
KATP-Kanals, bestätigt werden. Die mittels 3H-P1075 und 3H-GBC
untersuchte GBC-Bindung verlief jeweils zweistufig: Die erste,
hochaffine (KD = 36 nM) Bindungsstelle (20 der spezifischen
GBC-Bindung) liegt am SUR und ist mit der Öffnerbindungsstelle negativ
allosterisch gekoppelt. Die Stöchiometrie der ersten
GBC-Bindungsstelle und der P1075-Bindungsstelle beträgt 1:1. Die
zweite, niederaffine (µM Bereich) Bindungsstelle liegt an einem
unbekannten, vermutlich endogenen Protein. Im Gegensatz zur
Öffnerbindung ist die GBC-Bindung von der Intaktheit des Zytoskeletts
abhängig. Im zweiten Teil wurde an mit SUR2B transfizierten
HEK293-Zellmembranen (human embryonal kidney cells) erstmalig das
Bindungsverhalten von P2- (Purin- bzw. Pyrimidin-) Rezeptor-Modulatoren
untersucht. Ziel war die Auffindung neuartiger
KATP-Kanal-Blocker, die über eine Senkung der Reninfreisetzung aus den
juxtaglomerulären Zellen der Niere zur Bekämpfung des renalen
Hochdrucks beitragen könnten. Phloxin B, Suramin, Evans Blue bzw. DIDS
(4-4'- Diisothiocyanostilben-2,2'-disulfonsäure) verdrängten 3H-P1075
vom SUR ein- bzw. zweistufig. Die Verdrängung verlief
nicht-kompetitiv mit 3H-P1075, die Bindungsstelle(n) der
Testsubstanzen ist (sind) negativ mit der 3H-P1075-Bindungsstelle
gekoppelt. Eine Interaktion mit den Nukleotidbindungsstellen konnte
nicht ausgeschlossen werden. Die genaue Lokalisation der
Bindungsstelle ist noch nicht bekannt.
Abstract:
The first part of this thesis investigates the binding of the
radioligands 3H-P1075 (potassium channel opener) and 3H-Glibenclamid
(3H-GBC, potassium channel blocker) to A10 cell membranes (smooth
muscle cells of the embryonal rat aorta) as a model of the vascular
ATP sensitive potassium channel (KATP) and compares it to earlier
results of binding experiments on whole cells. As found in those
earlier investigations there was only one binding site for P1075 to
A10 cell membranes. This site is located at the sulfonylurea receptor
(SUR) which is the ß-subunit of the vascular KATP. The potassium
channel blocker GBC showed a two-phase binding using 3H-P1075 and
3H-GBC. The first binding site (20 of the specific binding of GBC)
with high affinity (KD = 36 nM) is located at SUR and is coupled in a
negative allosteric manner to the opener binding site. The
stoichiometry of the first GBC binding site and the binding site for
P1075 is 1:1. The second binding site of GBC was of low affinity (µM
range) and is located at an unidentified, probably endogenous
protein. In contrast to the opener binding the binding of GBC depends
on the integrity of the cytoskeleton. The second part investigates
the binding of P2- (purine-/pyrimidine-) receptor modulators to SUR2B
expressed in membranes of HEK293 cells (human embryonal kidney cells)
in order to find new blockers of the KATP, which might reduce the
secretion of renin from the juxtaglomerular cells of the kidney and
thus help to fight against renal hypertension. Phloxin B, Suramin,
Evans Blue and DIDS (4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonate)
inhibited 3H-P1075 binding to SUR showing a one- respectively
two-phase binding. The inhibition was non-competitive with 3H-P1075
and the binding site(s) of the test compounds were coupled in a
negative allosteric manner to the binding site of 3H-P1075. The exact
localization of the binding site is not yet identified.