Das Tff Gen-Cluster, verantwortlich für die gastroprotektiven Kleeblattpeptide, und die gerichtete Inaktivierung des Tff2 Gens in der Maus

Abstract

Kleeblattpeptide (TFF) sind kleine sezernierte Proteine, die eine wichtige Rolle bei Wund-heilungsprozessen und dem Schutz des Verdauungstraktes spielen. Das Ziel dieser Arbeit war es, Grundlagen für das Verständnis der Funktion des Tff2 Gens zu schaffen. Für die humanen Kleeblattproteine sind keine natürlich vorkommenden Mutationen, welche zu konstitutionellen Krankheiten führen könnten, bekannt. Daher sind die sogenannten 'Knockout-Mäuse' für die Grundlagenforschung von großer Bedeutung, um neue Einblicke in die Wirkungsweise der Kleeblattproteine zu erlangen. In dieser Arbeit sollte das natürlich vorhandene Tff2 Gen ausgeschaltet werden, um pathologische Situationen zu simulieren und dadurch die physiologische Funktion des Genproduktes aufzuklären. Durch homologe Rekombination wurde ein Allel des Tff2 Gens in den embryonalen Stammzellen der Maus ersetzt. Dazu wurde ein Zielvektor (pL2-?m2) konstruiert, in welchem das murine Kleeblattgen Tff2 deaktiviert vorliegt. Darüber hinaus wurde das mutierte Allel in die Keimbahn der heterozygoten (Tff2+/-) Tiere erfolgreich integriert. Basierend auf diesen Charakterisierungen werden nun die heterozygoten (Tff2+/-) Tiere untereinander gekreuzt, um letztendlich die Tff2 (-/-) Knockout-Maus zu züchten. Die Erzeugung dieser Maus wird die Familie der bereits bestehenden Kleeblatt-Knockout-Mäuse komplettieren. Als Grundlage für diese Arbeit wurde die genomische Struktur der murinen Kleeblattfamilie bestimmt. Drei bakterielle und eine von der Hefe abstammende Rekombinante (BACs und YAC) wurden identifiziert und für die detaillierte Charakterisierung durch PCR, Restriktionskartierung, Hybridisierung, und Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) verwendet. Daraus ergab sich, dass in der Maus die drei Tff Gene ähnlich wie im menschlichen TFF Gen-Cluster angeordnet sind. Sie erstrecken sich über eine Länge von ca. 40 kb in der transkriptionellen Anordnung Tff1-Tff2-Tff3 auf Chromosom 17.

Trefoil peptides (TFFs) are a group of small secreted proteins, which play an important role in the protecting and healing processes of the stomach and intestine. The aim of these experiments was to create a basic foundation for understanding the exact function and/or the mode of action of the Tff2 gene. Since in the case of human trefoil peptides, no naturally occurring chance mutations leading to constitutional diseases had been discovered, a straight forward experimental approach for new insight into this trefoil peptide function is to engineer a strain of so-called knock-out mice, in which Tff2 is missing. By employing a replacement strategy, one allele of Tff2 was substituted in ES cells by homologous recombination in order to create the Tff2 knock-out mouse. The primary aim of this project was to construct the targeting vector (pL2-?m2), whereby the mouse trefoil gene Tff2 was disrupted, and to characterise the germline transmission of the mutant allele in heterozygous (Tff2+/-) animals. Indeed, this goal was realised within the scope of this work. In the near future, the mice will be mated inter se to generate the mutant Tff2 (-/-) knockout mice, completing the family of already existing trefoil knockout mice. To obtain fundamental information about the mouse trefoil gene cluster, the genomic structure was determined. Three bacterial and one yeast artificial chromosome recombinants (BACs and YAC) were identified and used for detailed characterisation by PCR, restriction mapping, hybridisation, and fluorescence in situ hybridisation (FISH). In a similar fashion to the TFF gene cluster in humans, the mouse Tff genes cover a region of approximately 40 kb in the transcriptional order Tff1-Tff2-Tff3 and are localised on chromosome 17.