Identification and functional analysis of Hox downstream genes in Drosophila

Abstract

A wide variety of morphological features have arisen over the course of evolution of bilateral organisms. A significant number of these features depend on the expression of Hox genes, a set of highly conserved genes encoding transcription factors. Different Hox genes are expressed along the anterior-posterior axis of the embryo. The presence or absence of specific Hox transcription factors in a region determines what kind of morphological structures will form. The mechanism by which Hox transcription factors control the development of such vastly different structures has eluded researchers for decades, especially in light of their ability to bind to nearly identical DNA-sequences in vitro. This has sparked a debate over how Hox proteins effect the development of different structures. It was proposed that a select few target genes were differentially regulated by Hox proteins, thereby leading to the observed morphological differences. Alternatively, it was proposed that Hox proteins influence the expression of many downstream genes at a time. Many minor changes in expression would then accumulate to a greater effect and explain how Hox proteins achieve the major effects on morphology observed along the body axis. To elucidate the mechanism of Hox protein function, we carried out a comparative analysis of Hox downstream gene regulation at a quantitative level. Drosophila melanogaster embryonic stages 11 and 12 were examined and the number of downstream genes under Hox protein control was determined in these two stages. We then used the set of Hox downstream genes to create a bioinformatic tool for direct target gene prediction for the Hox protein Dfd. With the data collected, we were able to establish the degree to which Hox proteins differ in the regulation of their downstream genes and were able to show that Hox transcription factors act on a variety of different downstream genes. The latter result is a significant finding, as, in contrast to previous views, our results indicate that Hox proteins do not primarily act on other transcription factors.

Eine Vielzahl unterschiedlicher morphologischer Strukturen ist im Verlauf der Evolution entstanden. Eine signifikante Anzahl dieser Strukturen benötigt die Expression einer hoch konservierten Gen-Familie, der Hox Gene. Diese Hox Gene kodieren Transkriptionsfaktoren und werden in unterschiedlichen Regionen entlang der anterior-posterior Körperachse eines Embryos exprimiert. Die Anwesenheit oder Abwesenheit spezifischer Hox Proteine bestimmt, welche Art von Strukturen in der entsprechenden Region entstehen. Der Mechanismus, mit dem Hox Transkriptionsfaktoren die Entwicklung solch unterschiedlicher Strukturen bewirken, ist bis heute noch nicht bekannt, obwohl sich Wissenschaftler nunmehr bereits seit Jahrzehnten mit dieser Frage beschäftigen. Die Ursache dafür ist die Eigenschaft von Hox Proteinen in vitro an fast identische DNA-Sequenzen zu binden. Zur Zeit werden zwei Theorien diskutiert, auf welche Weise Hox Proteine in vivo die unterschiedliche Entwicklung morphologischer Strukturen auslösen. Eine Theorie geht davon aus, dass Hox Proteine einige wenige Gene, so genannte “Schlüssel”-Gene, spezifisch regulieren. Eine andere Theorie nimmt an, dass Hox Proteine die Expression vieler verschiedener Gene auf einmal regulieren. Leichte Veränderungen in der Expression dieser Gene würden akkumulieren und so einen größeren Effekt bewirken. Dadurch würde eine Erklärung für die großflächigen Effekte von Hox Proteinen auf morphologische Strukturen geliefert. Um einen fundierten Beitrag zur Klärung dieser Streitfrage zu leisten, haben wir eine quantitative Analyse durchgeführt, welche die Auswirkungen der Überexpression der unterschiedlichen Hox Proteine auf die Genregulation vergleicht. Hierzu haben wir die embryonalen Stadien 11 und 12 von Drosophila melanogaster untersucht. Zudem haben wir ein bioinformatisches Programm entwickelt, um Gene zu identifizieren, die von dem Hox Protein Dfd reguliert werden. Mit Hilfe der ermittelten Daten haben wir den Grad, in dem sich Hox Proteine in der Regulation der Gene unterscheiden, determiniert und konnten zeigen, dass Hox Proteine nicht, wie zunächst angenommen, primär die Expression weiterer Transkriptionsfaktoren regulieren, sondern eine Vielzahl unterschiedlicher Gen-Klassen.