Inhaltszusammenfassung:
Bei Stickstoffmangel differenziert das filamentöse Cyanobakterium Anabaena sp. PCC 7120 N2-fixierende Heterozysten aus vegetativen Zellen. Um die sauerstoffempfindliche Nitrogenase zu schützen, lagern Heterozysten eine spezifische Schicht aus Heterozysten-Glykolipiden (HGLs) auf der Heterozystenzellwand ab, welche als O2-Diffusionsbarriere dient. In dieser Arbeit wurde der Exporter der HGLs identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass DevBCA und TolC eine ATP-getriebene Effluxpumpe (oder ein Typ-1-Sekretionssystem) bilden, welche die gesamte Zellhülle durchspannt und für die Translokation von HGLs über die Gram-negative Zellwand erforderlich ist. DevA und DevC stellen einen integralen ABC-Exporter in der Cytoplasmamembran dar, TolC bildet eine Pore in der äußeren Membran, und das periplasmatische Protein DevB verbindet beide Membranproteine.
DevAC reagierte auf die Anwesenheit von angereicherten HGLs durch eine Erhöhung der ATP-Hydrolyse-Aktivität. Diese Reaktion war strikt abhängig von DevB, jedoch nicht von TolC. Durch Oberflächenplasmonresonanz und Isothermale Titrationskalorimetrie konnte ein DevB-Hexamer vorhergesagt werden, welches sowohl mit DevAC als auch mit TolC interagierte. Mutationen in DevB, die die Bildung eines Hexamers beeinträchtigten, führten zu einem starken Rückgang der Bindungsaffinitäten zu DevAC und TolC. Erweiterte Struktur-Funktions-Analysen mit modifizierten Varianten der Teilnehmer bestätigten eine zentrale Rolle des DevB-Hexamers bei der Interaktion mit TolC. Weiterhin konnte eine Zahnrad-ähnliche Interaktionsschnittstelle zwischen den Spitzen der α-helicalen Domänen von DevB und TolC festgestellt werden.
Darüber hinaus konnte nur ein DevB-Hexamer die Substraterkennung von DevAC vermitteln. Alle Varianten von DevB, bei denen die Hexamerisierung beeinträchtigt war, waren dazu nicht in der Lage. Die physiologische Relevanz dieser Beobachtung wurde in Komplementationsstudien mit einer DevB-Variante demonstriert, die durch die Mutation einer einzigen Aminosäure in der Hexamerisierung beeinträchtigt war. Diese Variante konnte den Phänotyp einer devB-Mutante nicht komplementieren (Heterocysten waren nicht in der Lage, HGLs zu exportieren). DevBCA-TolC -oder Typ-1-Sekretions-Systeme im Allgemeinen- stellen einen neuartigen Weg des Glykolipidexports dar.
Zudem wurden in dieser Arbeit sechs zu devBCA homologe Gencluster im Genom von Anabaena sp. PCC 7120 analysiert. Durch Inaktivierung des jeweiligen zu devB homologen Gens konnte gezeigt werden, dass all0809-7 und all5347-6 unabdingbar für das diazotrophe Wachstum sind. Weiterhin wurde gezeigt, dass auch All0809/8/7-TolC eine typische ATP-getriebene Effluxpumpe wie DevBCA-TolC bilden. Jedoch konnten im Gegensatz zu DevBCA-TolC keinerlei Substrate identifiziert werden. In dieser umfassenden Studie wurden die ersten TolC-abhängigen, ATP-getriebenen, und die Zellhülle-durchspannenden Effluxpumpen von Cyanobakterien beschrieben.
Abstract:
On depletion of combined nitrogen, the filamentous cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 forms N2-fixing heterocysts from vegetative cells. To protect the oxygen-sensitive nitrogenase, a heterocyst-specific layer composed of heterocyst glycolipids (HGLs) that functions as an O2-diffusion barrier is deposited on top of the heterocyst cell wall. In this work, the exporter of the HGLs was identified. DevBCA and TolC were shown to form an ATP-driven trans-envelope efflux pump (or type 1 secretion system) required for the translocation of HGLs across the Gram-negative cell wall. DevA and DevC form a cytoplasmic membrane-integral ABC exporter, TolC is an outer membrane-integral pore, and DevB is a periplasmic connector between both membrane proteins.
DevAC was responsive toward HGLs by increasing its ATP-hydrolyzing activity. This feature was absolutely depending on the presence of DevB, but not TolC. Surface plasmon resonance and isothermal titration calorimetry predicted a DevB hexamer interacting with both DevAC and TolC. Mutations in DevB that impaired hexamer formation led to a remarkable decrease in binding affinities to DevAC and TolC.
Advanced structure-function investigations using modified variants of the participants confirmed a central DevB hexamer interacting with TolC, and further predicted a cogwheel-like tip-to-tip interaction interface between them.
In addition, only a DevB hexamer was able to promote substrate recognition of DevAC. All DevB variants impaired in hexamerization were not able to do so. The physiological relevance of this observation was demonstrated in complementation studies using a single site mutation variant of DevB impaired in hexamerization. This variant was not able to rescue the phenotype of a mutant in devB (heterocysts were not able to export HGLs). DevBCA-TolC -or type 1 secretion systems in general- reflect a novel pathway of glycolipid export.
Furthermore, six close homologues of DevBCA predicted from the genome of Anabaena sp. PCC 7120 were analyzed in this work. Two of them, All0809/8/7 and All5347/6, were shown to be crucial for diazotrophic growth by inactivating the respective DevB homologue. All0809/8/7-TolC could also be shown to form a typical ATP-driven efflux pump like DevBCA-TolC. However, a distinct substrate could not be identified. In this comprehensive study, the first TolC-dependent ATP-driven trans-envelope efflux pumps of cyanobacteria were described.
Cyanobacteria , Heterocyst , Abc transporter , Efflux pump , Glycolipids
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