Involvement of Deafness Dystonia Protein 1 in the Pathomechanism of Deafness-Dystonia-Optic Neuronopathy Syndrome

Abstract

Deafness-Dystonia-Optic Neuronopathy (DDON) syndrome is a rare X-linked progressive neurodegenerative disorder resulting from mutations in the TIMM8A gene encoding for the deafness dystonia protein 1 (DDP1). Despite important progress in identifying and characterizing novel mutations in this gene, little is known about the underlying pathomechanism. Deficiencies in the biogenesis of hTim23 and consecutive alterations in biogenesis of inner membrane and matrix proteins have been proposed to serve as one possible mechanistic explanation. To shed new light on the role of DDP1 in the biogenesis of mammalian mitochondria, we investigated the effects of reduced or elevated DDP1 levels on mitochondrial dynamics and function. Our results show a reduction in the import of beta-barrel proteins into mitochondria from cells overexpressing DDP1. This effect was not observed when the DDON-related mutant form DDP1-C66W was overexpressed. Live cell microscopy of primary fibroblasts derived from DDON patients and of DDP1 downregulated HeLa cells displayed alterations of mitochondrial morphology with notable extensions in the length of mitochondrial tubules, whereas overexpression of DDP1 induced the formation of hollow spherical mitochondria. Interestingly, overexpression of TIMM13 alone, or both TIMM13 and DDP1, revealed a wild-type phenotype morphology. Blue native-PAGE analysis of cells with elevated amounts of DDP1 and TIMM13 showed a reduction of unassembled DDP1 with concomitant formation of high molecular mass complexes containing both proteins. These results support the notion that the unassembled DDP1 molecules might cause the phenotype of the DDP1 overexpressing cells. Of note, knockdown of the TIMM8A gene by RNA interference did not show an influence on the oxygen respiration rate and the mitochondrial membrane potential. Taken together, these results suggest that alterations in the levels of DDP1 can affect the morphology of mitochondria and thus shed new light on the pathogenetic mechanisms of DDON.

Das Deafness-Dystonia-Optic Neuronopathy (DDON) Syndrom ist eine seltene X- chromosomale, fortschreitende neurodegenerative Erkrankung resultierend aus Mutationen im TIMM8A Gen, welches für das deafness dystonia protein 1 (DDP1) kodiert. Trotz wichtiger Fortschritte in der Identifizierung und Charakerisierung neuer Mutationen dieses Gens ist wenig bekannt über den zugrunde liegenden Pathomechanismus. Fehler in der Biogenese von hTim23 und daraus folgende Veränderungen in der Biogenese von Proteinen der inneren Mitochondrienmembran und der Matrix wurden als eine mögliche mechanistische Erklärung vorgeschlagen. Um neues Licht auf die Rolle von DDP1 in der Biogenese in Mitochondrien von Mammalia zu werfen, haben wir die Effekte von vermindertem und vermehrtem DDP1 auf die mitochondriale Dynamik und Funktion erforscht. Unsere Ergebnisse zeigen eine Reduktion von importierten beta-barrel Proteinen in Mitochondrien aus Zellen mit überexprimierten DDP1. Dieser Effekt konnte in Zellen, die eine DDON assoziierte Mutante, DDP1-C66W, überexprimierten, nicht beobachtet werden. Mikroskopie primärer Fibroblasten von DDON Patienten und HeLa Zellen mit vermindertem DDP1 zeigte Veränderungen der mitochondrialen Morphologie mit erkennbaren Verlängerungen von mitochondrialen, tubulären Strukturen, wohingegen DDP1 Überexpression die Formation hohler, sphärischer Mitochondrien zur Folge hatte. Interessanterweise resultierte Überexpression von TIMM13 alleine oder TIMM13 und DDP1 gleichzeitig in einer Wildtyp-Morphologie. Blau Nativ PAGE Analyse von Zellen mit erhöhten Mengen an DDP1 und TIMM13 hatte eine Reduktion von unassemblierten DDP1 zur Folge mit gleichzeitiger Bildung hochmolekularer Komplexe bestehend aus beiden Proteinen. Diese Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass nicht assemblierte DDP1 Moleküle den Phänotyp von DDP1 überexprimierenden Zellen verursachen könnten. Bedeutenswerterweise zeigte die Herunterregulation des TIMM8A Gens mittels RNA Interferenz keine Auswirkung auf die Sauerstoffverbrauchsrate und das mitochondriale Membranpotential. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Veränderungen in der Expression von DDP1 Auswirkungen auf die Morphologie von Mitochondrien haben können und zeigen somit einen neuen Aspekt des Pathomechanismus von DDON.