Structure-Function Analysis of a Cyanobacterial Protein Phosphatase 2C Homologue

Abstract

Reversible protein phosphorylation affects the structure and the function of proteins that are responsible for the regulation of nearly all biological processes in living organisms. PPM/PP2C type phosphatase is one main subfamily of protein phosphatase. In Synechocystis sp. pcc 6803, a PPM/PP2C type phosphatase PphA was proven to be the specific phosphatase of phosphorylated PII (PII-P). The crystal structure of tPphA, which is the homologue protein of PphA from Thermosynechococcus elongatus, was solved. As other bacterial PPM/PP2C phosphatases, tPphA also contains three divalent cautions (M1, M2, and M3) in the catalytic center. By reviewing the literature of PPM/PP2C, the catalytic mechanism of PPM/PP2C was not fully understood. The questions about why there is a third metal (M3) in the catalytic center and who is the proton donor for the leaving group were not answered. Taking tPphA as an example, the aspartate residues coordinating the three metal ions were mutated by site-directed mutagenesis. The enzyme kinetic parameters of tPphA variants were obtained as to explain the function of tPphA metal center. The M3 variants (D119A, D119E, D119T, and D193A) only showed residual activity towards different substrates. The crystal structures of tPphA variants D119A and D193A were resolved in this dissertation. The crystal structures of D119A and D193A only showed M1 and M2 are in the catalytic centers. Since the pKa value of one water molecule (WH) coordinated by M3 is less than 14, therefore, M3 presumably supplies WH as proton donor for the leaving group. In addition, since the crystal structures of tPphA and PII was known and tPphA could dephosphorylate PII, thus these two proteins represent well suited examples to study fundamental properties of PPM/PP2C substrate recognition. tPphA is devoid of a regulatory domain and only has a flexible loop (termed flap subdomain) close to the catalytic center. The great variability of PPM/PP2C primary sequence and tertiary structure was observed in this flap subdomain. Thus, flap subdomain may help tPphA to recognize PII-P. The three metal ions constitute a huge positive charged group in the catalytic cavity of tPphA, which may assist tPphA to interact with the phosphate group of substrates. On the other hand, there is a highly conserved histidine residue (H39) close to the catalytic center of tPphA. Whether this histidine residue participate in specifically interacting with PII was not known. In this dissertation, a new binding method combined with chemical cross-linking and pull-down was developed to determine the substrate specificity of tPphA. H39 of tPphA was identified to play a key role in recognizing protein substrate. M1-M2 cluster in the catalytic center, but not M3 is required for the binding of phosphorylated substrate. The flap subdomain not only affects tPphA catalytic activity, but also may influence substrate specificity and binding.

Die reversible Proteinphosphorylierung beeinflusst die Struktur und die Funktion von Proteinen, welche an nahezu allen biologischen Prozessen in lebenden Organismen beteiligt sind. PPM/PP2C-Typ Phosphatasen stellen eine der Hauptunterfamilien von Proteinphosphatasen dar. In Synechocystis sp. PCC 6803 konnte gezeigt werden, dass eine PPM/PP2C-Typ Phosphatase die spezifische Phosphatase des PII-Proteins ist. Die Kristallstruktur von tPphA, dem homologen Protein von PphA aus Thermosynechoccus elongatus, konnte aufgelöst werden. tPphA war außerdem in der Lage, das PII-Protein zu dephosphorylieren. Trotz näherer Betrachtung der Literatur konnte der katalytische Mechanismus von PPM/PP2C jedoch nicht vollständig verstanden werden. Die Fragen, warum es ein drittes Metall im aktiven Zentrum gibt, und wer der Protonendonor für die Abgangsgruppe ist, wurden nicht beantwortet. Am Beispiel von tPphA wurden Aspartatreste mutiert, welche die drei Metallionen (M1, M2 und M3) koordinieren. Um die Funktion des Metallzentrums erklären zu können, wurden die enzymkinetischen Parameter dieser tPphA-Varianten gemessen. Die M3 varianten (D119A, D119E, D119T, und D193A) zeigten lediglich Restaktivität gegenüber verschiedenen Substratarten. In dieser Dissertation wurden die Kristallstrukturen der tPphA-Varianten D119A und D193A aufgelöst. Beide wiesen lediglich M1 und M2 im aktiven Zentrum auf. Somit konnte gezeigt werden, dass M3 eine Schlüsselrolle bei der Dephosphorylierungsreaktion von PPM/PP2C spielt. Wahrscheinlich stellt M3 ein Wassermolekül als Protonendonor für die Abgangsgruppe bereit. Die strukturellen Eigenschaften von PPM/PP2C, die für die spezifische Erkennung des Substrats verantwortlich sind, waren nicht hinreichend bekannt. Da die Kristallstruktur von tPphA bekannt ist und tPphA PII dephosphorylieren kann, stellen beide Proteine ein geeignetes Beispiel dar, um die grundlegenden Eigenschaften der PPM/PP2C-Substraterkennung zu studieren. tPphA weist keine regulatorische Domäne auf, es hat jedoch eine flexible Schleife (flap subdomain) in der Nähe des aktiven Zentrums. Diese flap subdomain könnte an der Erkennung von PII-P beteiligt sein. Das Metallzentrum von tPphA stellt eine große positive geladene Gruppe an der Oberfläche des Proteins dar, welche tPphA bei der Substraterkennung behilflich sein könnte. In der Nähe des katalytischen Zentrums befindet sich ein bei Bakterien hochkonserviertes Histidin. Es war nicht bekannt, ob dieser Histidinrest an der spezifischen Interaktion mit PII beteiligt ist. In dieser Dissertation wurde eine neuartige Bindemethode aus chemischen Cross-links und Pull-down entwickelt, um die Interaktion von tPphA mit PII untersuchen zu können. Es konnte gezeigt werden, dass H39 von tPphA eine zentrale Rolle bei der Erkennung von Proteinsubstraten spielt. Im katalytischen Zentrum sind M1 und M2 an der Bindung an das phosphorylierte Substrat beteiligt, jedoch nicht M3. Die flap subdomain beeinflusst nicht nur die katalytische Aktivität von tPphA, sie könnte auch die Substratspezifität und -bindung beeinflussen.