Charakterisierung der Aquaglyceroporine von Trypanosoma brucei

Abstract

Der Trypanosoma brucei Parasit ist der Erreger der Afrikanischen Schlafkrankheit und der Tierseuche Nagana. Er wird von Tsetse Fliegen verbreitet und sein komplexer Lebenszyklus kennt zwei teilungsaktive Stadien, die schlanke Form im Blut, in der Lymphflüssigkeit und im Gehirn des Säugetierwirtes und die prozyklische Form im Mitteldarm des Fliegen-Vektors. Für die Energieproduktion verlässt sich die Blutform des Parasiten ausschließlich auf Glukose, sie kann aber auch Glycerin verstoffwechseln. Die Glykolyse unterscheidet sich in Trypanosomen erheblich von anderen eukaryontischen Zellen, da hier die ersten sieben Schritte des Stoffwechselweges in einem speziellen Organell, den Glykosomen, ablaufen. Blutform Trypanosomen, da sie über keine Lactatdehydrogenase verfügen, nutzen Sauerstoff, um das NAD/NADH Verhältnis in den Glykosomen stabil zu erhalten und scheiden als Abfallprodukt Pyruvat aus. Unter Sauerstoffmangelbedingungen kann der Parasit eine glykosomale Glycerokinase nutzen, um das NAD/NADH Gleichgewicht zu erhalten und er scheidet dann Glycerin als Abfallprodukt aus. Die prozyklische Form kann auch Glukose verwerten, nutzt aber vor allem Prolin als Energiequelle; diese Zellen verfügen über einen funktionierenden Krebs-Zyklus und die Fähigkeit zur oxidativen Phosphorylierung. Während seines Lebenszyklus ist das Trypanosom erheblichen Osmolaritätsschwankungen ausgesetzt. Um mit dem Wasser- und Glycerintransport über Membranen hinweg klar zu kommen, besitzen sie drei Aquaglyceroporine, die weiterhin auch durchlässig sind für einige ungewöhnliche Stoffe wie Ammoniak, Arsen oder Antimon. Anti-Peptid Antikörper gegen jedes der drei Aquaglyceroporine wurden zur Lokalisierung eingesetzt. Immunfluoreszenz-Aufnahmen zeigten AQP1 in der Flagellummembran, wohingegen AQP3 exklusiv in der Plasmamembran lokalisiert war. Für AQP2 konnte die Verortung auf intrazellulare Organellmembranen eingegrenzt werden. Zur weiteren Charakterisierung der Aquaglyceroporine wurden RNA Interferenz-Zelllinien verwendet. Ein vererbbarer und induzierbarer RNAi-Vektor wurde für jedes der drei Aquaglyceroporine und für einen simultanen Knockdown aller Aquaglyceroporine kloniert. Das Plasmid wurde zur Erschaffung von prozyklischen und Blutform Aquaglyceroporin-RNAi-Zelllinien eingesetzt. Nachdem der erfolgreichen Verifizierung der Knockdowns mittels Northern Blots, wurden die Zellen auf phänotypische Wachstumsveränderungen und ihr Verhalten im hypoosmolaren Stress überprüft. Die AQP1-RNAi-Trypanosomen, prozyklische Form und Blutform, wiesen Knockdown-Raten von 99 % und 83 % auf. Diese Zelllinien zeigten keine Wachstumsinhibition. Weiterhin zeigten sie eine verlängerte Schwellzeit in Übereinstimmung mit ihrer Lokalisation in der Flagellummembran und eine normale Volumenreduktion im hypoosmolaren Stress (150 mosm). Für die erfolgreichen AQP3-RNAi-Trypanosomen führte der Mangel an AQP3 in der Plasmamembran zu keiner Wachstumsinhibition. Sie zeigten eine normale Volumenreduktion im hypoosmolaren Stress und eine stark verlängerte Schwellzeit. Sowohl für die prozyklischen als auch die Blutformen der AQP2-RNAi-Zellen konnte eine Transkriptreduktion für AQP2 von etwa 60 bis 70 % dokumentiert werden. Der Fliegenform-Knockdown wuchs normal und zeigte eine Standard-Regulatorische-Volumenreduktion. Die Blutform AQP2-RNAi-Zellen waren sensitiver bezüglich des fehlenden AQP2 in den intrazellularen Organellmembranen. Sie zeigten eine phänotypische Wachstumsverzögerung und große Probleme im hypoosmotischen Stress-Test. Diese Trypanosomen zeigten eine normale Schwellzeit, aber während der Volumenreduktions-Phase starb eine Hälfte der Zellen ab und die andere Hälfte brauchte eine längere Zeit um vollends wieder auf Ausgangsgröße zurück zu schrumpfen. Dies zeigte auf, dass AQP2 eine wichtige beziehungsweise überlebenswichtige Rolle in der regulatorischen Volumenantwort spielt. Die prozyklischen und Blutform AQP1-3 Knockdown-Zelllinien zeigten mRNA-Reduktionen für AQP1, AQP2 und AQP3 von 97, 61 und 67 Prozent beziehungsweise 99, 73 und 94 Prozent. Diese Gesamt-AQP-Knockdown-Zellen, wenn sie hypoosmolaren Bedingungen ausgesetzt waren, zeigten Schwellzeiten, die sich nicht signifikant von denen der aufsummierten AQP-Einzelknockdowns unterschieden, eine normale Volumenreduktion und keine Wachstumsinhibition. Die Blutformen des AQP1-3 Knockdowns überlebten den hypoosmolaren Schock, da der gleichzeitige Knockdown von AQP1 und AQP3 das initiale Anschwellen verlangsamte und damit der wahrscheinliche Initial-Stimulus für den osmoregulatorischen Effekt von AQP2 stark abgeschwächt wurde. Die Blutform AQP1-3 Knockdown-Trypanosomen wurden einem Glycerin-Überlebenstest unterzogen. Trotz ihres Mangels an den Glycerinkanälen AQP1, AQP2 und AQP3 waren diese Trypanosomen in der Lage nur mit Glycerin als alleinigem Energiesubstrat im Medium zu überleben. Sie transportierten Glycerin ins Cytosol und weiter in die Glykosomen. Dies bestätigte das Vorkommen eines spezifischen Glycerintransporters in der Plasmamembran, das heißt eben solch eines Transporters wie er 1998 von Wille et al. postuliert wurde. Möglicherweise ist dieser Transporter auch verantwortlich für den Glycerintransport über die Glykosomenmembran hinweg.

The Trypanosoma brucei parasite causes Human African Trypanosomiasis, also known as sleeping sickness, and the animal disease Nagana in domestic livestock. It depends on the tsetse fly for dissemination and in its complex life cycle two dividing stages occur, the slender form in blood, lymphatic fluid, and brain of the mammalian host and the procyclic form in the midgut of the fly vector. For energy production bloodstream parasites rely on glucose, but alternatively they can also metabolize glycerol. Glycolysis in trypanosomes differs markedly from other eukaryotic cells, because the first seven reactions of the pathway are compartmentalized to a special organelle, called the glycosome. Bloodstream form trypanosomes, because of the absence of a lactate dehydrogenase, use oxygen to maintain the NAD/NADH balance in the glycosome and throw out pyruvate. Under low oxygen conditions, the parasite can utilize a glycosomal glycerol kinase to maintain NAD/NADH homeostasis and produce glycerol as waste. The procyclic forms can feed on glucose too, but mainly use proline as an energy source; they have a functional tricarboxylic acid cycle and oxidative phosphorylation capabilities. In its life cycle the trypanosome is also subjected to considerable variations of osmolarity. To cope with water and glycerol transport across membranes, they have three aquaglyceroporins, which are furthermore permeable for small uncharged solutes such as ammonia, arsenic or antimony. Peptide-derived antibodies directed against each individual aquaglyceroporin were used for localization. Immunofluorescence staining showed AQP1 in the flagellar membrane, whereas AQP3 was exclusively localized to the plasma membrane. For AQP2 the localization could be narrowed down to non-specific intracellular membranes. RNA interference cell lines were used to further characterize the aquaglyceroporins. A heritable and inducible RNAi vector was cloned for each individual aquaglyceroporin knockdown and one for a simultaneous knockdown of all three AQPs. The plasmids were used to create procyclic and bloodstream form RNAi cell lines. After verifying the success of the knockdown clones via Northern blot, the cells were checked for phenotype changes like growth inhibition or their response to a hyposmotic shock. The procyclic and bloodstream form AQP1 knockdowns were 99 % and 83 % complete, respectively. These cell lines showed no growth inhibition. They exhibited a prolonged swelling time in accordance with their flagellar membrane localization and a normal volume recovery when exposed to hyposmotic stress (150 mosm). For the successful AQP3 RNAi trypanosomes the lack of AQP3 in the plasma membrane also led to no growth inhibition, a normal recovery from hyposmotic stress conditions and a profoundly prolonged time for cell swelling. Both the procyclic and bloodstream form AQP2 knockdowns exhibited only a mild reduction of AQP2 transcripts to about sixty percent of normal levels. The fly form knockdown grew normal and showed a standard regulatory volume recovery. The bloodstream form AQP2 knockdown trypanosomes were more sensitive to intracellular organelles missing AQP2. They exhibited a growth defect and had severe problems in the hyposmotic stress test. These trypanosomes showed a normal swelling time but during the volume recovery phase one half of the cells died and the others took longer to recover fully. This suggested a part for TbAQP2 in the regulatory volume recovery process. The procyclic and bloodstream form AQP1-3 knockdown cells showed mRNA reductions for AQP1, AQP2 and AQP3 of 97, 61 and 67 percent and 99, 73 and 94 percent, respectively. These triple knockdown cell lines, when exposed to hyposmotic conditions, showed a maximum swelling time equal to the additive single knockdown maximum swelling times, normal volume recoveries and no growth inhibition. The simultaneous knockdown of aquaglyceroporin 1 and 3 attenuated the initial cell swelling, the probable initial stimulus for the suggested role of aquaglyceroporin 2 in the regulatory volume recovery. The bloodstream form AQP1-3 knockdown trypanosomes were also subjected to a glycerol survial test. Despite their lack of the glycerol channels aquaglyceroporins 1 to 3, the cells were able to survive on a minimal medium only containing glycerol as an energy source. They transported glycerol into the cytosol and further into the glycosomes. This confirmed the existence of a specific glycerol transporter in the plasma membrane, just as the one proposed by Wille et al. in 1998 and it stands to reason that the same glycerol facilitator may be the one responsible for the glycerol transport via the glycosomal membrane.