Massenspektrometrie-basierte Analyse von Tumorzelllinien mit neuartigen peptidspezifischen Antikörpern – ein universeller Ansatz zur Proteomanalyse

Abstract

In der Proteomforschung haben sich massenpektrometriebasierte Strategien zur Schlüsseltechnologie für die Identifizierung von Proteinen entwickelt. Trotz großer Fortschritte in den letzten Jahren stellt die effiziente Präfraktionierung komplexer Proben vor der Analyse eine große Herausforderung dar. Leistungsfähige analytische Plattformen, die für die Proteomanalyse geeignet sind, sind mit massenspektrometriebasierten Systemen entwickelt worden. Hierfür ist jedoch eine aufwändige Probenvorbehandlung notwendig, im Besonderen um niedrig konzentriert Zielproteine nachzuweisen. Meist werden elektrophoretische (2D-Gele) und chromatographische Prinzipien kombiniert und zur Probenfraktionierung eingesetzt. Neuentwicklungen im Bereich immunaffinitätsbasierter Methoden besitzen die Potenz, den sensitiven Nachweis definierter Zielanalyten nach spezifischer Anreicherung deutlich zu verbessern. Durch Kombination einer immunaffinitäts-basierten Fraktionierungsmethode mit einem massenspektrometriebasierten Ausleseverfahren können definierte Zielmoleküle selektiv und sensitiv analysiert und quantifiziert werden. Die Limitierungen der bestehenden immunaffinitätsbasierten Probenpräfraktionierung bestehen in der geringen Verfügbarkeit geeigneter Bindemoleküle und der hieraus resultierenden niedrigen Auflösung dieser Methode. Um diese Limitierungen zu umgehen wurde in dieser Arbeit ein Konzept entwickelt, das auf einer neuen speziellen Art von peptidspezifischen Antikörpern basiert. Peptidspezifische Antikörper werden in der Regel gegen lineare Epitope bestehend aus einer Sequenz von 8 bis 14 Aminosäuren generiert. Peptidspezifische Antikörper sind jedoch nur in geringem Umfang kommerziell erhältlich. Mit dieser Arbeit soll untersucht werden, ob die gezielte Generierung von Antikörpern gegen kurze terminale Erkennungssequenzen bestehend aus vier Aminosäuren möglich ist. Diese Antikörper erkennen kurze, aus vier Aminosäuren bestehende Epitope, die sich am N oder C-Terminus eines Proteinfragments befinden. Sie binden nicht nur einen spezifischen Analyten, sondern sind in der Lage Gruppen von Peptiden mit demselben kurzen terminalen Motiv zu binden. Durch bioinformatische Berechnungen kann die Identität des so detektierbaren Subproteoms durch die Wahl bestimmter Epitope gesteuert werden. Je nach Wahl der Sequenz lässt sich die Größe des gewünschten Subproteoms steuern. Definierte Subproteome können aus wenigen Dutzend bis einigen Hundert Analyten mit demselben Terminus bestehen. Die Epitope können so gewählt werden, dass Sequenzen aus hochkonzentrierten Proteinen unberücksichtigt bleiben und mehrheitlich Peptidsequenzen aus mittleren bis niedrigen Konzentrationsbereichen bevorzugt werden. Mit dem klassischen Ansatz, der auf der Grundlage protein- bzw. peptidspezifischer Antikörper beruht sind für die Analyse des humanen Genoms über 20.000 Bindemoleküle notwendig. Mit dem hier beschriebenen neuartigen Ansatz können theoretisch mit wenigen tausend Antikörpern über 90% des in Datenbanken verzeichneten humanen Proteoms abgedeckt werden Limitierungen bezüglich der Verfügbarkeit geeigneter Bindemoleküle und der geringen Auflösung bisheriger immunaffinitätsbasierender Fraktionierungsmethoden könnten durch die Generierung einiger Hundert bis weniger Tausend dieser speziellen Antikörper aufgehoben werden. Im Gegensatz zum Ein-Analyt-Ein-Antikörper Ansatz bleibt hier die Möglichkeit zur Biomarkerentdeckung bestehen. Die Überprüfung dieses Konzepts wurde anhand des Modellproteins beta-Catenin geführt. Es wurden vier Peptide, die nach proteolytischem Abbau des Modellproteins mit Trypsin freigesetzt wurden ausgewählt, um polyklonale terminusspezifische Antikörper im Kaninchen zu generieren. Die gewonnenen Antiseren konnten mit Peptid-Mikroarrays auf Spezifität und Selektivität untersucht und die Bindungsepitope mit Hilfe von Peptidpositionsbibliotheken genau definiert werden. Methoden zur Antikörperaufreinigung wurden etabliert und verschiedene terminusspezifische Antikörper zur Herstellung von kleinen Immunaffinitätssäulen eingesetzt. Der Nachweis der Funktion der Methode wurde in der Maus-Zelllinie HepF1 geführt. Mit den eingesetzten terminusspezifischen Antikörpern konnten neben den beta- Cateninfragmenten 41 weitere Proteine detektiert werden. Das Prinzip mit einem Antikörper mehrere Peptide spezifisch anzureichern konnte somit gezeigt werden. Mit Hilfe von Glykogen Synthetase Kinase 3 Inhibitor behandelten und unbehandelten HEK-293 Zellen konnten unterschiedliche Zustände in den Proben dargestellt werden. Der speziesübergreifende Einsatz wurde durch den Einsatz humaner und Maus-Proben demonstriert. Damit konnte gezeigt werden, dass das hier evaluierte Konzept eine wichtige Erweiterung bereits bestehender affinitätsbasierter Anreicherungsstrategien darstellt und neue effiziente Wege zur Analyse komplexer biologischer Proben mit Hilfe der Massenspektrometrie ermöglicht.

Mass spectrometry and peptide-centric approaches are powerful techniques for the identification of differentially expressed proteins. Despite to enourmous improvements in MS technologies sample preparation and efficient fractionation of target analytes are still major bottlenecks in MS-based protein analysis. The complexity of tryptically digested whole proteomes needs to be considerably reduced before low abundant proteins can be effectively analysed using MS/MS. Unbiased, proteomic discovery approaches require extensive sample processing in order to reduce their complexity prior to MS analysis. The proteins in a biological sample therefore have to be separated using physico-chemical methods, e.g. 2D gels. Alternatively, proteins can be enzymatically fragmented and the resulting peptides be separated using multi-dimensional chromatography methods. All these technologies are well established and allow the identification of a moderate number of proteins present in a sample. However, it is necessary to validate the identified proteins, i.e. biomarker candidates, using much larger sample cohorts. For validation the analytical strategy has to be switched from a knowledge-independent to a knowledge-based approach due to cost and time restrictions. Peptide-specific antibodies proved to be a valuable tool to capture signature peptides derived from the potential biomarkers. The target analytes can be isolated from tryptically digested biological samples in a single affinity step, which enables the absolute quantification of selected peptides from digested clinical samples to physiologically relevant analyte concentrations with a high level of precision and accuracy. However, the lack of appropriate peptide-specific capture reagents limits the broad application of immunoaffinity-based approaches since this method relies on one specific antibody per target, several tens of thousands of antibodies need to be generated for application in large-scale proteomic research. Immunoaffinity-based methods are also used in unbiased approaches to reduce sample complexity. Antibodies that are able to bind generically to phosphorylated tyrosine or acetylated lysine were used for the enrichment of tryptic peptide fragments derived from post-translationally modified proteins. A consequent extension of existing immunoaffinity MS concepts is the development and use of peptide group-specific antibodies targeting common peptide sequences. The present work focuses on a special type of anti-peptide antibodies – Triple X Proteomics Antibodies. These antibodies are capable of trapping groups of peptides that share a common epitope of three to four amino acids at the N- or C-terminal end; this short amino acid sequence is referred to as TXP epitope. In contrast to classical peptide-specific antibodies, these antibodies can be selected and generated so as to bind dozens to hundreds of peptides that share the same epitope. beta-catenin was used as a model protein to demonstrate the effective generation and application of TXP antibodies. Polyclonal rabbit antibodies were generated against four short peptide termini that were present in four theoretical beta-catenin-specific signature peptides, followed by affinity purification. Affinity purified antibodies were thouroughly characterized using positional scanning peptide libraries in combination with suspension bead array technology. Herewith amino acid residues of the epitope relevant for antibody-antigen interaction could be determined. Finally, the characterized affinity purified antibodies were applied in an immunoaffinity enrichment step of peptide classes from tryptically digested tumour cells. The subsequent MALDI-MS/MS readout enabled the direct identification of beta-catenin and more than 40 other signature peptides in complex biological samples. This proof-of-principle study reveals the potential of the TXP concept in providing antibodies for knowledge-dependent and knowledge-independent protein analysis. This demonstrates the general applicability of the TXP approach to proteomics applications such as biomarker discovery and validation, through the provision of antibodies for peptide-class enrichment.