Role of Ion Channels and Exchangers in the Regulation of Dendritic Cells

Abstract

Dendritische Zellen (DZ) sind Antigen-präsentierende Zellen und stellen ein Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität dar. Ca2+-vermittelte Signaltransduktionswege spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation der Immunantwort von DZ auf verschiedene Antigene, einschließlich Toll-ähnlichen Rezeptor-Liganden, intakten Bakterien und mikrobiellen Toxinen. Die zugrundeliegenden Mechanismen die bei Aktivierung von DZ zu einem Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration [Ca2+]i führen, sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Behandlung von DZ der Maus mit Lipopolisaccharid (LPS, 100 ng/ml) oder Peptidoglykan (PGN, 25 µg/ml) führte zu einem raschen Anstieg der [Ca2+]i, welcher sich aus der Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern sowie dem Einstrom von extrazellulärem Ca2+ durch die Plasmamembran zusammensetzte. Der Effekt von PGN auf [Ca2+]i war deutlich beeinträchtigt, wenn die DZ von TLR2-defizienten Mäusen isoliert wurden. Patch-Clamp-Experimente in der Whole-Cell-Konfiguration zeigten, dass die durch LPS induzierten Ströme Übereinstimmungen mit ICRAC aufweisen. Die Ströme waren hoch selektiv für Ca2+ und wiesen eine deutliche Einwärtsausrichtung der Strom-Spannungs-Beziehung, eine anormale Molfraktion sowie eine schnelle Ca2+-abhängige Inaktivierung auf. Weiterhin war der LPS- und PGN-induzierte Anstieg der [Ca2+]i von der Aktivität spannungsregulierter K+ (Kv) Kanäle abhängig. Die Expression von MHC Klasse II-Molekülen, CCL21-abhängige Migration sowie die Produktion von Zytokinen durch DZ waren in der Gegenwart von Blockern für Kv- und CRAC-Kanäle reduziert, während die phagozytische Aktivität der Zellen erhöht war. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors nuclear factor kappaB (NF-kappaB), erfasst als Phosphorylierung des inhibitorischen Moleküls I kappaB, war in der Gegenwart von Kv- und CRAC-Blockern nicht verändert.

Glucocorticoide haben eine starke immunosuppressive Wirkung und hemmen die Aktivität von DZ. Weiterhin sind DZ primäre Angriffspunkte für das Secosteroidhormon 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3), welches zusätzlich zu seiner gut etablierten Wirkung auf den Ca2+-Haushalt immunomodulatorische Eigenschaften besitzt. Über die Effekte von 1,25(OH)2D3 und Dexamethason auf Ca2+-Kanäle und -Transporter in DZ ist bisher nichts bekannt. Der LPS-induzierte Anstieg der [Ca2+]i in DZ der Maus wurde durch vorausgegangene Inkubation der Zellen mit 1,25(OH)2D3 (100 nM, 24 h) oder Dexamethason (10 nM, über Nacht) signifikant gehemmt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass DZ sowohl K+-unabhängige (NCX1-3) als auch K+-abhängige (NCKX 1, 3-5) Na+/Ca2+-Austauscher exprimieren. Die Aktivität dieser Na+/Ca2+-Austauscher konnte unter Entfernung der extrazellulären Na+-Ionen bei gleichzeitiger Anwesenheit von Ca2+-Ionen erfasst werden. Der Vorgang hatte einen Ca2+-Einstrom zufolge, der zu einem messbaren, vorübergehenden raschen Anstieg der [Ca2+]i sowie einem auswärtsgerichteten Strom führte, welcher mittels Patch Clamp in der Whole-Cell-Konfiguration erfasst werden konnte. Der durch Entfernung des extrazellulären Na+ hervorgerufene Anstieg der [Ca2+]i sowie der resultierende Auswärtsstrom wurden sowohl durch 1,25(OH)2D3 als auch durch Dexamethason verstärkt. Während 1,25(OH)2D3 einen Effekt auf K+-abhängige Na+/Ca2+-Austauscher hatte, wirkte Dexamethason auf K+-unabhängige Na+/Ca2+-Austauscher. Dexamethason führte weiterhin zu einer Erhöhung der Transkriptionsrate von NCX2 und NCX3. Folglich hemmen 1,25(OH)2D3 und Dexamethason den LPS-induzierten Anstieg der [Ca2+]i mittels Stimulation des Transports von Ca2+ aus der Zelle durch Na+/Ca2+-Austauscher. 1,25(OH)2D3 beeinflusste die [Ca2+]i weiterhin zusätzlich durch die Hochregulation des Ca2+-Bindungsproteins Calbindin-D28K und bewirkte somit eine Erhöhung der Pufferkapazität der Zellen für Ca2+. 3’,4’-Dichlorobenzamyl, ein Blocker für NCKX, hob den hemmenden Effekt von 1,25(OH)2D3 auf den LPS-induzierten Anstieg der [Ca2+]i wieder auf. Der hemmende Effekt von 1,25(OH)2D3 und Dexamethason auf die Expression des co-stimulatorischen Moleküls CD86 konnte mithilfe von 3’,4’-dichlorobenzamyl bzw. KB-R7943, Blocker für NCKX bzw. NCX, wieder aufgehoben werden.

Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells that provide a link between innate and adaptive immunity. Ca2+-mediated signal transduction pathways play a central regulatory role in DC responses to diverse antigens, including Toll-like receptor (TLR) ligands, intact bacteria, and microbial toxins. However, the mechanisms leading to increased [Ca2+]i upon DC activation are poorly understood. In the present study, treatment of mouse DCs with either lipopolysaccharide (LPS, 100 ng/ml) or peptidoglycan (PGN, 25 µg/ml) resulted in a rapid increase in [Ca2+]i which was due to Ca2+ release from intracellular stores and influx of extracellular Ca2+ across the cell membrane. In DCs isolated from tlr2-/- mice the effect of PGN on [Ca2+]i was dramatically impaired. In whole-cell voltage-clamp experiments, LPS-induced currents exhibited properties similar to ICRAC. These currents were highly selective for Ca2+, exhibited a prominent inward rectification of the current-voltage relationship, an anomalous mole fraction and a fast Ca2+-dependent inactivation. Furthermore, the LPS- and PGN-induced incrase in [Ca2+]i was dependent on voltage-gated K+ (Kv) channel activity. MHC class II expression, CCL21-dependent migration, and cytokine production decreased, whereas phagocytic activity increased in LPS- or PGN-stimulated DCs in the presence of both Kv and CRAC channel blockers. Activation of the transcription factor nuclear factor kappaB (NF-kappaB), assessed as phosphorylation of inhibitory molecule I kappaB, was not affected by CRAC or Kv channel blockers.

The activity of DCs is suppressed by glucocorticoids, which induce potent immunosuppressive effects. Furthermore, DCs are primary targets of 1,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3), a secosteroid hormone, that, in addition to its well-established action on Ca2+ homeostasis, possesses immunomodulatory properties. Nothing is known about the effects of 1,25(OH)2D3 and glucocorticoids on Ca2+ channels and transporters in DCs. The LPS-induced increase in [Ca2+]i in mouse DCs was significantly blunted by prior incubation of the cells with either 1,25(OH)2D3 (100 nM, 24 h) or dexamethasone (10 nM, overnight). It could be further shown that DCs express both, K+-independent (NCX1-3) and K+-dependent (NCKX1, 3-5), Na+/Ca2+ exchangers. The activity of Na+/Ca2+ exchangers was assessed by removal of extracellular Na+ in the presence of external Ca2+, a maneuver that triggers the entry of extracellular Ca2+ and resulted in a measurable, rapid transient increase in [Ca2+]i and an outwardly rectifying current measured in whole cell patch-clamp experiments. Both 1,25(OH)2D3 and dexamethasone enhanced the increase in [Ca2+]i and the outward current following removal of external Na+. While the effect of 1,25(OH)2D3 affected K+-dependent Na+/Ca2+ exchangers, the action of dexamethasone was directed against K+-independent Na+/Ca2+ exchangers. Furthermore, dexamethasone increased the transcript levels of NCX2 and NCX3. Thus, 1,25(OH)2D3 and dexamethasone blunt the LPS-induced increase in [Ca2+]i by stimulation of Na+/Ca2+ exchanger-dependent Ca2+ extrusion. In addition, 1,25(OH)2D3 further modulated [Ca2+]i by upregulating the Ca2+-binding protein calbindin-D28K and thereby the Ca2+ buffer capacity of the cells. The NCKX blocker 3’,4’-dichlorobenzamyl reversed the inhibitory effect of 1,25(OH)2D3 on LPS-induced increase of [Ca2+]i. Expression of the costimulatory molecule CD86 was down-regulated by 1,25(OH)2D3 and dexamethasone, an effect reversed by 3’,4’-dichlorobenzamyl and KB-R7943, blockers of NCKX and NCX, respectively.