Biological evaluation of novel peptidic vectors for transmembrane delivery of intracellularly targeted probes for molecular imaging

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-43379
http://hdl.handle.net/10900/43918
Dokumentart: PhDThesis
Date: 2009
Language: English
Faculty: 8 Zentrale, interfakultäre und fakultätsübergreifende Einrichtungen
Department: Interfakultäres Institut für Zellbiologie (IFIZ)
Advisor: Nordheim, Alfred (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2009-10-09
DDC Classifikation: 500 - Natural sciences and mathematics
Keywords: Molekulare Bildgebung , Kontrastmittel , Peptide
Other Keywords: Gezielter Transport , Zellpenetrierende Peptide , Transmembrantransport , Intrazelluläre Kontrastmittel
Molecular imaging , Cell penetrating peptides , Targeting , Transmembrane delivery, Intracellular contrast agents
License: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_mit_pod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

Nicht-invasive Bildgebungstechniken, wie die Magnetresonanztomograhie (MRT), bieten die Möglichkeit molekular-genetische und zelluläre Prozesse zu beobachten. Exogen verabreichte Substanzen für die Molekulare Bildgebung sind allerdings nicht in der Lage ihre molekularen und zellulären Ziele zu erreichen, da die Lipiddoppelschicht der Zellmembran eine effektive natürliche Barriere darstellt. Eine einzigartige Klasse von Peptiden, auch bekannt als zellpenetrierende Peptide (CPPs), haben aber die Eigenschaft diese Barriere zu überwinden und an sie gekoppelte Moleküle durch die Zellmembran zu transportieren. Im ersten Teil der Arbeit wurden zwei MR basierte Kontrastmittel entwickelt, die eine bestimmte mRNA einer Zelle als Zielstruktur haben. Dazu wurde das HIV-1 Tat Peptid als Transporter verwendet, da es am effizientesten in Zellen aufgenommen wurde. In zellfreien in vitro Assays konnte gezeigt werden, dass sie selektiv an eine komplementäre Oligonukleotidsequenz binden konnten. Diese Kontrastmittel induzierten ebenfalls eine signifikante Kontrasterhöhung in MR Bildern markierter Zellen. Es konnte allerdings keine signifikante Anreicherung in Zellen beobachtet werden, die die Ziel-mRNA enthielten. Gründe für die fehlende Spezifität könnten die hohe nicht-spezifische Bindung der non-sense Sequenz sein oder aber die niedrige Sensitivität der MRT. Der Hauptgrund liegt aber in der endosomalen Anreicherung der Kontrastmittel, die eine spezifische Wechselwirkung mit den Zielmolekülen im Zytosol verhindert. Der zweite Teil der Arbeit basierte daher auf der Suche nach neuartigen CPP, die effizient gekoppelte Moleküle ins Zytosol transportieren können, um eine bessere Wechselwirkung mit zytosolischen Zielmolekülen wie mRNA, Proteinen etc. zu ermöglichen. Eine intensive Struktur-Wirkungs-Studie wurde mit einer Peptidsequenz aus dem Hauptbestandteil des Giftes einer südamerikanischen Klapperschlange durchgeführt. Diese soll die Fähigkeit haben, Moleküle in den Zellkern zu transportieren. CyLoP-1 (CRWRWKCCKK) konnte als ein cysteinreiches CPP mit sowohl deutlicher zytosolischer Diffusion als auch endosomaler Aufnahme bereits bei niedrigen Konzentrationen identifizierte werden. Die weitere biochemische Charakterisierung wurde durchgeführt, um die einzigartige intrazelluläre Verteilung von CyLoP-1 besser zu verstehen. Unsere Ergebnisse deuten dabei darauf hin, dass zumindest zwei mögliche Mechanismen daran beteiligt sind. Zum einen handelt es sich um Endozytose, wie schon für viele andere CPP berichtet, und zum anderen entweder um eine direkte Aufnahme über die Zellmembran ins Zytosol oder eine Neuverteilung nach retrogradem Transport aus den Endosomen/Lysosomen heraus. CyLoP-1 hat das Potential als neuartiger Transporter für die zytosolische Anlieferung von Wirkstoffen genutzt zu werden.

Abstract:

Noninvasive imaging techniques like MRI possess the prospective to observe molecular-genetic and cellular processes. But the exogenously administered molecular imaging agents are unable to reach their molecular and cellular targets as the lipid bilayer of the cell poses a formidable natural barrier. However, a unique class of peptides known as cell penetrating peptides or CPPs has the ability to traverse this barrier and convey cargo molecules attached to it across the cell membrane. Thus the combination of CPPs with MR/optical agents would permit the evaluation of cellular processes through the interaction of imaging probes with intracellular targets like proteins, mRNA or DNA. In the first part of the thesis, two mRNA targeting MR based contrast agents were designed using the most efficiently transporting derivative of HIV-1 Tat. In vitro cell free studies depicted their ability to selectively bind to complementary oligonucleotide sequence. The agents also showed a significant MR contrast enhancement in labeled cells. However, no specific enrichment was observed in transgenic target containing cells. Some reasons hypothesized to reason the lack of specificity of these agents were the high non-specific binding of the non-sense sequence or the low sensitivity of MRI. But the primary cause could be the entrapment of most of the compound in vesicles, thus, hindering their interaction with specific mRNA. The second part of the thesis was based on the search for a CPP that could efficiently deliver cargos into the cytosol permitting there interaction with cytosolic targets like mRNA, proteins, etc. Extensive Structure Activity Relationship (SAR) studies were carried out on a putative nuclear localization sequence derived from the main toxin in snake venom. CyLoP-1 was identified as a cysteine rich CPP with distinguished cytosolic diffusion as well as endosomal uptake at low concentrations. Further characterization of the biochemical properties and understanding of the unique intracellular localization of CyLoP-1 was performed. Our results indicate the involvement of two possible mechanisms. One is the endocytosis as reported for several other CPPs and the other could either be a direct delivery across membrane or a re-distribution after retrograde transport. Nevertheless, CyLoP-1 has potential for exploitation as a novel tool for cytosolic delivery of cargos.

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