The role of the transcription factor SRF in the inhibition of senescence in human and porcine smooth muscle cells

Abstract

This PhD thesis deals with the role of the transcription factor SRF (serum response factor) in smooth muscle cell proliferation and cellular senescence. An siRNA approach was used to reduce SRF in human and porcine primary smooth muscle cells. These cells are much closer to the real in vivo situation than immortalized cell lines.

siRNA-transfection did not lead to an interferon response. siSRF797 showed a highly specific downregulation in human as well as in porcine SMCs. Sequencing of Sus scrofa SRF showed a very high evolutionary conservation when compared to Homo sapiens. Therefore, the siRNA can be tested in the porcine animal model and later in clinical trials.

Downregulation of SRF caused a block in G1/S transition. TP53 upregulation and SKP2 protein downregulation led to an increase in CDKN1B protein, which was responsible for the senescence induction. siSKP2-transfection showed a similar increase in senescent cells, but only a slight increase of CDKN1B could be determined. Therefore, the downregulation of SKP2 is not the only reason for the strong increase of CDKN1B after siSRF797-transfection. A cotransfection of siCDKN1B+siSRF797 could rescue the senescent phenotype. So in conclusion, the CDKN1B upregulation is the main inducer of senescence after downregulation of SRF.

The data lead to the conclusion that SRF plays a key role in the inhibition of cellular senescence in human and porcine smooth muscle cells.

Diese Dissertation untersucht die Rolle des Transkriptionsfaktors SRF (Serum response factor) in der Zellproliferation und zellulären Seneszenz von Glattmuskelzellen. Die siRNA-Technik wurde verwendet, um SRF in primären Glattmuskelzellen von Mensch und Schwein zu reduzieren. Diese Zellen kommen der in vivo Situation viel näher als immortalisierte Zelllinien.

Die Transfektion der siRNAs zeigte keine Induktion einer Interferon-Antwort. siSRF797 zeigte eine starke und spezifische Reduktion in Glattmuskelzellen von Mensch als auch von Schwein. Sequenzanalysen von SRF in Sus scrofa zeigten eine hohe Konservierung, so dass diese siRNA sowohl im Tiermodell Schwein als auch später in klinischen Studien verwendet werden kann.

Eine Reduktion von SRF führte zu einem Block im G1/S-Übergang. Eine Hochregulierung von TP53 und eine Runterregulierung des SKP2-Proteins hatten eine erhöhte Expression von CDKN1B zur Folge, die für die Induktion der Seneszenz verantwortlich ist. Eine siSKP2-Transfektion zeigte einen ähnlich hohen Anstieg der seneszenten Zellen, aber führte nur zu einer geringen Erhöhung von CDKN1B. Daher ist die Erniedrigung des SKP2-Proteins nicht der einzige Grund für den starken Anstieg von CDKN1B nach siSRF797-Transfektion. Eine Kotransfektion von siCDKN1B+siSRF797 konnte die Seneszenz verhindern. Zusammenfassend ist also die Hochregulierung von CDKN1B für die Induktion der Seneszenz nach Runterregulierung von SRF verantwortlich.

Diese Daten führen zu der Folgerung, dass SRF eine Schlüsselrolle in der Inhibition der zellulären Seneszenz in Glattmuskelzellen von Mensch und Schwein innehat.