Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Parkinson-assoziierten Proteins DJ-1

Abstract

In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die strukturellen und funktionellen Eigenschaften des Parkinson-assoziierten Proteins DJ-1 anhand seiner Reprimierung des ASK1-JNK/p38-Signalwegs untersucht. Es wurde von uns bereits früher gezeigt, dass DJ-1 ASK1 bindet und seine Aktivität reprimiert. Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, welche oxidierbaren Aminosäurereste von DJ-1 für seine Aktivierung und die Bindung an ASK1 notwendig sind. Es wurde gezeigt, dass Cystein-106 der wichtigste oxidierbare Rest und notwendig für die Bindung an ASK1 und die cytoprotektive Funktion von DJ-1 ist. Die Oxidation von Cys-106 kann durch die konstitutiv aktiven Mutanten [C106DD]DJ-1 und [C106EE]DJ-1 simuliert werden. Die peripheren Cysteine 46 und 53 sowie die PD-assoziierte Mutante M26I tragen zur Ausbildung stabiler Homodimere bei. Cys-46 und Cys-53 modulieren die oxidationsabhängige Aktivierung von DJ-1. Die PK-assoziierte Mutante [M26I]DJ-1 hat eine verringerte Proteinstabilität, eine gestörte oxidationsabhängige Aktivierung und bindet nicht-funktionell an ASK1. Dies könnte zur Pathogenese der M26I-Mutantenträger beitragen und einen generellen Einfluss auf die Parkinsonerkrankung haben. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Mechanismus der ASK1-Reprimierung durch DJ-1 erforscht. DJ-1 unterdrückt oxidationsabhängig die Aktivität von ASK1. Die geschieht durch einen disulfidbrückenabhängigen Einbau in das ASK1-Signalosom. Hierbei wird nicht die Phosphorylierung von ASK1 beeinflusst, sondern die Rekrutierung von Effektorproteinen. Dieser Vorgang verhindert dann die vollständige Aktivierung des ASK1-Signalosoms. Im dritten Teil der Arbeit wurde DJ-1 als evolutionär konservierter Regulator der angeborenen Immunität identifiziert. Der Verlust von DJ-1 in Astrozyten führt zu einer Hyperstimulation des p38-Signalwegs. Die anderen MAP-Kinase-Signalwege werden kaum und der NFkB-Signalweg wird überhaupt nicht beeinflusst. Die Hyperaktivität des p38-Signalwegs resultiert in einer ca zehnfach stärkeren Produktion von Stickstoffmonoxid durch eine verstärkte Expression der induzierbaren NO-Synthase. Weitere Effekte des DJ-1-Verlusts sind die verstärkte Induktion von COX-2 und den proinflammatorischen Zytokinen IL-1b und IL-6. Die Deregulation der astrozytären Entzündungsantwort führt zu einem verstärkten Absterben kokultivierter kortikaler Neurone. Die Neuroinflammation ist somit ein wichtiger Faktor in den neurodegenerativen Prozessen, die durch den Verlust von DJ-1 ausgelöst werden. Die Reprimierung des ASK1-p38-Signalwegs wurde somit als wichtige Komponente des zytoprotektiven Mechanismus von DJ-1 bei neuroinflammatorischen Prozessen identifiziert.

The aim of this study was the structural and functional characterization of the Parkinson's disease-associated protein DJ-1 with respect to its repression of the ASK1-JNK/p38 signaling pathway. It had been shown by us before that DJ-1 binds to and represses ASK1. In the first part I studied the oxidizable amino acids responsible for the activation of DJ-1 and the binding to ASK1. I showed that cysteine 106 is the most important oxidizable residue and necessary for the binding to ASK1 and the cytoprotective function. Oxidation of C-106 can be mimicked by the constitutively active mutants [C106DD]DJ-1 and [C106EE]DJ-1. The peripheral cysteins 46 and 53 as well as the PD-associated mutant [M26I]DJ-1 contribute to the formation of stable homodimers. C-46 and C-53 modulate the oxidation dependent activation of DJ-1. [M26I]DJ-1 is less stable, has an impaired activation and binds non-functionally to ASK1. This could contribute to the pathogenesis of M26I mutant carriers. The second part of this study deals with the mechanism of ASK1 repression by DJ-1. DJ-1 represses oxidation dependent the activation of ASK1. DJ-1 is incorporated into the ASK1 signalosome via disulfide bonds. The incorporation does not influence the phosphorylation of ASK1 but the recruitment of effector proteins.This suppresses the activation of the signalosome. The third part of the study identified DJ-1 as an evolutionary conserved regulator of innate immunity. Loss of DJ-1 in astrocytes leads to a hyperstimulation of p38 signaling pathway. Other MAPK pathways are only weakly influenced and the NFkB pathway is not influenced at all. Hyperactivity of p38 leads to a 10 times increase in nitric oxide production due to an increased expression of inducible NO synthase. Futher effects of the loss of DJ-1 are an increased induction of COX-2 and the proinflammatory cytokines IL-1b and IL-6. Deregulation of astrocyte inflammatory response leads to an increased apoptosis of cocultured cortical neurons. Therefore neuroinflammation is an important factor in neurodegenerative diseases which is triggered by the loss of DJ-1. Repression of the ASK1-JNK/p38 signaling pathway has been identified as a major cytoprotective mechanism of DJ-1 during neuroinflammation.