Etablierung und Charakterisierung von Modulatoren der cGMP-abhängigen Proteinkinase Typ I

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-37289
http://hdl.handle.net/10900/43904
Dokumentart: Dissertation
Date: 2009
Language: German
Faculty: 8 Zentrale, interfakultäre und fakultätsübergreifende Einrichtungen
Department: Interfakultäres Institut für Biochemie (IFIB)
Advisor: Feil, Robert (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2008-12-18
DDC Classifikation: 570 - Life sciences; biology
Keywords: Cyclo-GMP
Other Keywords: Signaltransduktion , cGKI , PKG , Inhibitoren
Signalling , cGKI , PKG , Inhibitors
License: Publishing license including print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Die cGMP-abhängige Proteinkinase Typ I (cGKI) ist eine im Cytosol vorliegende Ser/Thr-Proteinkinase, die durch den sekundären Botenstoff cGMP aktiviert wird. Die cGKI ist an verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt, wie etwa an der Regulation des Blutgefäßtonus, der Thrombocytenaggregation, der Darmperistaltik und auch an komplexeren Vorgängen wie Lernen und Gedächtnis. Es gibt Hinweise darauf, dass die cGKI neben ihrer essentiellen Rolle bei der Relaxation der glatten Muskulatur auch pathologische Prozesse in der Blutgefäßwand begünstigt. Diese könnten hauptsächlich auf einer cGKI-abhängigen Stimulation der Proliferation, Migration und Dedifferenzierung glatter Gefäßmuskelzellen (vascular smooth muscle cells, VSMCs) beruhen. Ähnliche Veränderungen der VSMCs gehen mit der Entwicklung der in der westlichen Welt bedeutendsten Gefäßerkrankung, der Atherosklerose, einher. Die Hemmung der cGKI könnte folglich einen neuen therapeutischen Ansatz für die Behandlung der Atherosklerose darstellen. Da in Säugern zwei Isoformen der cGKI existieren (alpha und beta), die beide in den VSMCs exprimiert werden, ist die Etablierung isoformspezifischer Inhibitoren zur weiteren Untersuchung der (patho-)physiologischen Funktionen der jeweiligen cGKI-Isoform dringend notwendig. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das inhibitorische Potential der zurzeit am häufigsten verwendeten cGKI-Inhibitoren, Rp-8-Br-PET-cGMPS (Rp-PET) und Rp-8-pCPT-cGMPS (Rp-pCPT), validiert. Rp-PET konnte cGKI-vermittelte Prozesse in intakten VSMCs, z.B. VASP-Phosphorylierung und beschleunigtes Zellwachstum, nicht effizient hemmen. Vielmehr aktivierte Rp-PET alleine partiell die genannten cGKI-vermittelten Prozesse. In vitro hemmte Rp-PET zwar die cGMP-induzierte Kinaseaktivität beider Isoformen, stimulierte jedoch in Abwesenheit des vollen Agonisten cGMP isoformspezifisch die Aktivität von cGKIalpha. FRET(fluorescence resonance energy transfer)-Messungen mit einem rekombinanten cGMP-Indikator, der die cGMP-Bindungsstellen der Kinase trägt, bestätigten die partiell agonistische Wirkung von Rp-PET. Der chemisch verwandte Inhibitor Rp-pCPT zeigte in Kinase-Assays einen ähnlichen partiell agonistischen Effekt auf cGKIalpha wie Rp-PET. Aufgrund dieser unerwarteten Ergebnisse scheinen Rp-PET und Rp-pCPT nicht zuverlässig genug für in vivo-Analysen der cGKI-Funktion zu sein. Eine Möglichkeit cGKI-vermittelte Prozesse isoformspezifisch zu hemmen, ist die Manipulation der N-terminalen Domäne. Diese ist der einzige Bereich, in dem sich cGKIalpha und beta auf Primärstrukturebene unterscheiden. Der N-Terminus trägt u. a. ein Leucin-Zipper-Motiv, das für die Homodimerisierung der cGKI-Isoformen und für die Interaktion mit anderen Proteinen zuständig ist. Die externe Zugabe des isolierten Leucin-Zippers könnte auf eine dominant-negative Art die Funktionen der Isoformen blockieren. Für diesen Zweck wurden die N-Termini der zwei Isoformen (HT-Ialpha-N und HT-Ibeta-N), bestehend aus dem Leucin-Zipper und der Pseudosubstratsequenz, als membrangängige, rekombinante Proteine exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Da von HT-Ialpha-N keine intakte, homogene Proteinpräparation hergestellt werden konnte, wurde dieses Konstrukt nicht weiter charakterisiert. Die Wirkung von HT-Ibeta-N auf cGKIalpha und beta in vitro, sowie auf VSMCs in Primärkultur wurde näher untersucht. HT-Ibeta-N reduzierte die Kinaseaktivität gereinigter cGKIbeta, aber nicht die gereinigter cGKIalpha und hemmte das cGKI-abhängige Wachstum von VSMCs. Erste Versuche mit VSMCs aus transgenen Mäusen, die nur eine der Isoformen exprimieren, deuteten darauf hin, dass der wachstumshemmende Effekt von HT-Ibeta-N auf eine selektive Inhibition der cGKIbeta-vermittelten Signaltransduktion zurückzuführen war. Um herauszufinden, ob die Hemmung der cGKI in Zellen durch HT-Ibeta-N auf den Leucin-Zipper allein zurückzuführen war, wurde dieser in Form kurzer, membrangängiger Peptide (tat-beta24 und tat-beta39) eingesetzt. Auch diese Peptide hemmten das cGKI-vermittelte Wachstum von VSMCs. Die isoformspezifische Manipulation der cGKI-Signaltransduktion über Peptide oder kleine Proteine stellt somit eine vielversprechende Möglichkeit zur weiteren Untersuchung der spezifischen Funktion der beiden cGKI-Isoformen dar. Möglicherweise könnten solche oder ähnliche cGKI-Inhibitoren auch zur Therapie von menschlichen Gefäßerkrankungen eingesetzt werden.

Abstract:

The cGMP-dependent protein kinase type I (cGKI), a cytosolic Ser/Thr protein kinase activated by the second messenger cGMP, plays an important role in a plethora of physiological processes ranging from regulation of vascular tone, thrombocyte aggregation and intestinal motility to learning and memory. However, beside its beneficial effects cGKI is also involved in the proliferation, migration and dedifferentiation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and thus might contribute to the development of a wide-spread vascular disease, atherosclerosis. Hence, the inhibition of cGKI might represent a novel therapeutic approach for the treatment of atherosclerosis. The mammalian cGKI exists in two isoforms, termed alpha and beta, that are both expressed in VSMCs. Since the isoform-specific functions of cGKI for physiological and pathophysiological processes in the vasculature are not clear, the establishment of isoform-specific inhibitors is warranted. In the present work, the inhibitory potential of the commonly used cGKI inhibitors, Rp-8-Br-PET-cGMPS (Rp-PET) and Rp-8-pCPT-cGMPS (Rp-pCPT), was validated. Rp-PET could not efficiently antagonise two cGKI-mediated processes in primary VSMCs, namely VASP phosphorylation and cell growth. In contrast, Rp-PET partially activated both processes. Kinase assays with purified cGKI confirmed the previously reported in vitro inhibition of the cGMP-stimulated enzyme by Rp-PET. However, in the absence of the agonist cGMP, Rp-PET partially activated cGKIalpha. Experiments with a fluorescence resonance energy transfer-based construct harbouring the cGMP binding sites of cGKI suggested that binding of Rp-PET induces a conformational change similar to the agonist cGMP. The closely related compound Rp-pCPT displayed a similar partially agonistic effect on cGKIalpha in vitro as Rp-PET. Taken together, these unexpected findings suggest that neither Rp-PET nor Rp-pCPT should be used as sole evidence to dissect the role of cGKI in signalling processes. For the establishment of new isoform-specific inhibitors, the N-terminal region of the enzyme might be a suitable target, since the two cGKI isoforms differ solely in their N-terminal ~100 amino acids. The N-terminus encloses a leucin-zipper motif, responsible for the homodimerisation of the enzyme and for the interaction with other proteins. Addition of the isolated leucin-zipper to the full-length enzyme might block the function of each isoform in a dominant-negative manner. The N-termini of cGKIalpha and cGKIbeta were expressed as small, membrane-permeable proteins (termed HT-Ialpha-N and HT-Ibeta-N) and were subsequently purified and characterised. Since no homogeneous protein preparation could be obtained from HT-Ialpha-N, this construct was not further analysed. The effects of HT-Ibeta-N on the activity of purified cGKIalpha and beta and on cGKI-mediated VSMC growth were studied. HT-Ibeta-N inhibited the kinase activity of cGKIbeta but not alpha and blocked the cGKI-dependent growth of wild-type VSMCs. Preliminary experiments with VSMCs isolated from transgenic mice, that express either of the isoforms in the smooth muscle, suggested that the growth repression by HT-Ibeta-N was due to isoform-specific inhibition of cGKIbeta signalling. To further investigate whether this effect arose from the leucin-zipper motif alone, short membrane-permeable peptides mimicking the leucin-zipper sequence were synthesised (tat-beta24 and tat-beta39). Indeed, these peptides could also inhibit cGKI-mediated VSMC growth. Targeting the N-terminus of cGKI by peptides or small proteins represents a new opportunity for the isoform-specific manipulation of cGKI signalling in intact cells and should help to resolve its isoform-specific functions. Similar cGKI inhibitors could eventually be used for the treatment of human vascular diseases.

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