Untersuchung der differenziellen Aktivierung von zellulären Signalübertragungswegen in Maus-Lebertumoren mit Mutationen im Ha-ras-, B-raf- oder Ctnnb1-Onkogen mit Protein-Mikroarray-basierten Methoden

Abstract

Veränderungen in Signaltransduktions- und Regulationsmechanismen sind eine Voraussetzung für die Entstehung von Tumoren. Diese führen zur Deregulation von Signalwegen und machen eine Rezeptorstimulation zur Aktivierung überflüssig. Mutationsbedingte Veränderungen dieser Signalwege wurden in Lebertumoren, die in einem Tiermodell nach chemischer Kanzerogenese erhalten wurden, auf ihre Auswirkungen hinsichtlich der Aktivität und Wechselwirkungen zu anderen Signalwegen untersucht. Analysiert wurden Mutationen im Erk/MAPK- (Ha-ras- oder B-raf-Gene) und im Wnt-Signalweg (Ctnnb1), welche auch beim Menschen eine zentrale Rolle bei der Tumorentstehung einnehmen. Die betroffenen Proteine haben zentrale regulatorische Bedeutung bei der Aktivierung der Signalwege und üben einen großen Einfluss auf die Proteinexpression der betroffenen Zellen aus. Mit Protein-Mikroarrays wurden vergleichende Expressionsanalysen auf Proteinebene von katalytisch oder regulativ aktiven Proteinen durchgeführt. Auf diesen hoch parallelisierten und miniaturisierten Festphasenassays wurden Lysate von bis zu 40 Tumor- und Normalgeweben aufgebracht. Die Signalgenerierung erfolgte durch ein Antikörper-basiertes Fluoreszenzdetektionsverfahren. Über die Bestimmung der immobilisierten Proteinmenge auf der planaren Oberfläche der Mikroarray-Substrate wurde ein Verfahren zur Normierung des Assaysignals etabliert. Die Bestimmung differenzieller Expression und Modifikation wurde für Proteine des Wnt- und Erk/MAPK-Signalweges, aber auch des Jak/STAT-, p38/MAPK-, JNK/SAPK- und mTOR-Signalweges, sowie Zell-Zellinteraktions- und Proliferationsmarker durchgeführt. Die Etablierung 60 weiterer Antikörper-basierter Assays ermöglichte eine semiquantitative Analyse von insgesamt 116 unterschiedlichen Analyten. Die gefundenen Proteinexpressionsmuster erlaubten eine klare Zuordnung der Proben in Tumore und Normalgewebe, sowie die Klassifizierung von Ctnnb1- oder Ha-ras- / B-raf-mutierten Tumoren. In mRNA-Expressionsmustern beobachtete Unterschiede zwischen Ctnnb1- oder Ha-ras- / B-raf-mutierten Tumoren, konnten auf Proteinebene bestätigt, sowie weitere zum Teil modifizierte Proteine differenziell gefunden werden. Anders als jedoch in mRNA-Expressionsanalysen konnten auch Unterschiede zwischen Ha-ras- und B-raf-mutierten Tumoren auf Proteinebene festgestellt werden. Während die Aktivität von zentralen Regulatoren (MEK, Erk, RSK) im Erk/MAPK- sowie JNK/SAPK im JNK/SAPK-Signalweg eindeutig verändert war, konnte ein messbarer Einfluss auf die Expression der durch diese Wege regulierten Zielgene nicht detektiert werden. Diese unterschiedlichen Aktivierungsmuster deuten auf zuvor nicht beschriebene differenzielle regulatorische Effekte der Ha ras und B raf Mutationen hin.

Changes in signal transduction and regulatory mechanisms are observed during the formation of tumours. These changes cause the deregulation of signalling pathways and often abolish the necessity of the receptor stimulation resulting in uncontrolled growth. Defined mutational changes in signalling pathways in liver tumours, generated in a aninmal model using chemical carcinogens, were analysed for their effects upon activity and interaction with other signalling pathways. These mutations are found in the Erk/MAPK (Ha-ras or B-raf gen) and in the Wnt signalling pathway (Ctnnb1), which play central roles in tumour development in humans. The affected proteins play a central role in the activation of the signalling and thereby have a major impact on protein expression in affected cells. Using protein microarrays a comperative protein expression analysis of catalytically active or regulatory active proteins was performed. Lysates from 40 tumour and normal tissues were analysed using highly parallel and miniaturised solid phase assays. Signal was generated using an antibody based fluorescence detection system. The determination of the amount of protein in the tissue sample was performed in a microarray format and a procedure for the normalisation of the assay signal was established. Differential expression and modification was determined for proteins of the Wnt and Erk/MAPK signalling pathway but also of the Jak/STAT, p38/MAPK, JNK/SAPK and mTOR signalling pathway; cell cell interaction and proliferation markers were also measured. The set-up of sixty new antibody based assays allowed a semiquantitative analysis of 116 different analytes. Protein expression profiles could be generated and allowed the classification of the samples into tumour and normal tissue groups as well as the allocation of Ctnnb1 or Ha-ras / B-raf mutated tumours. Known differences in mRNA expression patterns between Ctnnb1 or Ha-ras / B-raf mutated tumours could be confirmed on the protein level. Additional proteins and their modified forms were found to be differentially expressed. While mRNA expression analysis is not capable to detect differences between Ha-ras and B-raf tumours here differences on the protein level could be found. Despite the clearly changed activity of central regulators (MEK, Erk, RSK) of the Erk/MAPK as well as JNK/SAPK for the JNK/SAPK signalling pathway, an effect on the expression of target genes regulated by these pathways could not be detected. The identified differential activation patterns point towards a as yet undescribed differential regulatory effect of Ha-ras and B-raf mutations.