Wege des Exports von Glutathion aus Astrocyten

Abstract

Vorliegender Arbeit lag die Aufgabe zugrunde herauszufinden, welche(s) Transportsystem(e) außer dem Multidrug-Transporter 1 (multidrug resistance protein 1, MRP1) zum Austritt des Tripeptides Glutathion aus Primärkulturen von Astrogliazellen in das extrazelluläre Milieu beitragen. Als Grundlage für die Untersuchungen wurde zunächst an zwei Wildtyp Mausstämmen (NMRI und FVB/N) sichergestellt, dass astrogliareiche Primärkulturen aus Mäusen sowohl reduziertes als auch oxidiertes Glutathion exportieren. Die Kulturen unterschieden sich lediglich in quantitativer Hinsicht in Transportgeschwindigkeit und in Beeinflussbarkeit durch Mk571, einen Mrp1-Inhibitor. Die Transportcharakteristika analoger Kulturen aus FVB/N-Mäusen, dem Wildtyp von Mrp1-Knockout- und Mrp5-Knockout-Stämmen, glichen jedoch denen astrogliareicher Primärkulturen aus Ratte. So exportierten beide bei Anwendung von oxidativem Dauerstress innerhalb von 45 Minuten etwa 50 % des gesamt Gesamtglutathions in oxidierter Form, Kulturen aus NMRI-Mäusen nur etwa 25 % .

Die Feststellung dieser Ähnlichkeit war wichtig, da der Mrp1-vermittelte Efflux von reduziertem und oxidiertem Glutathion ursprünglich an Rattenkulturen untersucht worden war, Studien an Kulturen aus Knockout-Tieren aber nur mit Mäusen möglich sind. Untersuchungen an Astrogliakulturen aus Mrp1-Knockout-Mäusen ergaben, dass es für den Glutathiontransport unerheblich ist, ob Mrp1 pharmakologisch mit Mk571 oder durch Knockout des entsprechenden Gens ausgeschaltet wird. Zudem konnte gezeigt werden, dass der Efflux von reduziertem Glutathion aus Astrogliazellen, die aus Mrp1-Knockout-Mäusen gewonnen waren, von Mk571 nicht beeinflusst wird. Oxidiertes Glutathion konnte von diesen Kulturen überhaupt nicht mehr exportiert werden. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass Mrp1 in Astrocyten einerseits der einzige Transporter für oxidiertes Glutathion ist und andererseits der einzige Glutathiontransporter ist, der von Mk571 beeinflusst wird.

Mäuseastrogliazellen zeigten wie Rattenastrogliazellen einen von Mrp1 unabhängigen Restefflux von Glutathion. Bei der Suche nach Transportern, die an diesem Restefflux beteiligt sind, wurden als Kandidaten ausgewählt: Weitere Mitglieder der C-Familie der ATP-Bindungskassettentransporter (ABCC), zwei Mitglieder der Familie der Transportproteine für organische Anionen (OATP), sowie Connexone (auch Nexus-Halbkanäle oder gap-junction hemichannels genannt). Von diesen waren einzig Letztere in der Lage, Glutathion zu transportieren, jedoch nicht unter physiologischen Bedingungen. Verbleibende Kandidaten werden in der Diskussion ausführlich besprochen.

Ferner wurde mittels Connexin(Cx)43-Knockout-Mäusen versucht, den Connexon-vermittelten Glutathionefflux zu charakterisieren. Wegen des rasch eintretenden postnatalen Todes der Knockout-Tiere gelang es jedoch nicht, Cx43-Knockout-Kulturen zu gewinnen. Deshalb wurden auch Kulturen aus heterozygoten Tieren untersucht. Diese zeigten allerdings beim Connexon-vermittelten Glutathiontransport keinen Unterschied zum Wildtyp.

Im Rahmen vorliegender Arbeit wurde also kein einzelner am Restefflux von Glutathion beteiligter Transporter identifiziert. Jedoch konnten bereits mehrere andere Kandidaten - weitere ABCC-Transporter, OATPs, Connexone unter physiologischen Bedingungen - als für den Restefflux verantwortlich ausgeschlossen werden.

The aim of the present study was to discover (a) transport system(s) other than multidrug resistance protein 1 (MRP1) capable of facilitating efflux of the tripeptide glutathione from primary cultures of astroglial cells into the extracellular space. To create a basis for the investigation, experiments on cultures from two wild type mouse strains (NMRI and FVB/N)were undertaken to establish that astroglia-rich primary cultures are capable of exporting both reduced and oxidized glutathione. The cultures merely differed quantitatively in transport rate and extent of influence of Mk571, an inhibitor of MRP1. In analogous astroglia-rich primary cultures from FVB/N mice, the wild type strain corresponding to the Mrp1-knockout and Mrp5-knockout strains, the transport properties were very similar to that of astroglia-rich primary cultures from rat.Thus, during application of continuous oxidative stress both exported 50 % of their total glutathione in the oxidized form. In contrast, cultures from NMRI mice exported only 25 %.

Establishing this similarity was very important, since Mrp1-mediated efflux of reduced and oxidized glutathione had originally been observed in cultures from rats, whereas knockout studies can only be performed with mice. Experiments showed that it was irrelevant for glutathione efflux whether Mrp1 was shut down pharmacologically by Mk571 or by knockout of the corresponding gene. Furthermore it was shown that efflux of reduced glutathione from astroglia cells obtained from Mrp1-knockout mice was not influenced by Mk571. Furthermore, these cultures did not export oxidized glutathione at all. These results show clearly that in astrocytes Mrp1 is on the one hand the only transporter of oxidized glutathione and on the other hand the only glutathione transporter influenced by Mk571.

Astroglia cells from mice, like those from rat, showed a residual glutathione export independent from Mrp1. Several transport systems were examined as candidates responsible for this residual efflux: Other members of the C family of the ATP-binding cassette transporters (ABCC), two members of the family of organic anion transport proteins (OATP) and connexons (also called gap-junction hemichannels). Of these, solely the latter were able to transport glutathione, albeit not under physiological conditions. Remaining candidates are being reviewed extensively in the discussion chapter (Diskussion).

Furthermore,it was attempted to use connexin(Cx)43-knockout mice for the characterization of connexon-mediated glutathione efflux. However, due to the fast postnatal death of the knockout animals, it was not possible to obtain Cx43-knockout cultures. Therefore cultures from heterozygous animals were examined. Yet, regarding connexon-mediated glutathione transport they did not differ from wild type cultures.

Thus. in the present study no single transporter could be identified that is involved in the residual glutathione efflux. but several candidates, i.e., other ABCC transporters, OATPs and connexons under physiological conditions, could be excluded.