Entwicklung und Anwendung neuer Analyseverfahren zur Differenzierung muriner embryonaler Stammzellen

DSpace Repository


Dateien:
Aufrufstatistik

URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-34990
http://hdl.handle.net/10900/43895
Dokumentart: Dissertation
Date: 2008
Language: German
Faculty: 8 Zentrale, interfakultäre und fakultätsübergreifende Einrichtungen
Department: Interfakultäres Institut für Zellbiologie (IFIZ)
Advisor: Nordheim, Alfred (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2008-05-21
DDC Classifikation: 570 - Life sciences; biology
Keywords: Embryotoxizitätstest , Proteomanalyse , Zelldifferenzierung , Retinoesäure , Embryonale Stammzelle
Other Keywords:
Embryonic stem cells , Proteomics , Retinoic acid , Differentiation
License: Publishing license including print on demand
Order a printed copy: Print-on-Demand
Show full item record

Inhaltszusammenfassung:

In der vorliegenden Arbeit wurden neuartige Methoden zur Differenzierung muriner embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) angewandt und entwickelt, die Analysen früher Differenzierungsprozesse im Modellsystem, sowie die spezifische Differenzierung von Zelltypen ermöglichten. Die Einleitung der Differenzierung embryonaler Stammzellen erfolgte mit einem System (drop arrays) zur Aggregation von ES-Zellen, dessen Design die Erzeugung homogener embryoid bodies (EBs) in Massenkultur (mehrere tausend) ermöglichte. Das vorhandene drop array-System (Kammer, Patent) war Grundlage weiterer EB-Analyse-Verfahren. Mit einem visuellen Aufnahme-System (Live-Imaging-System) konnten frühe hämatopoetische Differenzierungsprozesse während der EB-Entwicklung dokumentiert werden. Die beobachteten hämatopoetischen Vorläufer konnten isoliert und zu hämatopoetischen Zellen der myeloischen Linien, sowie zu Mastzellpopulationen differenziert werden. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde der zeit- und konzentrationsabhängige Effekt des Morphogens Retinoinsäure analysiert. Mit einem EB-Dokumentations-System, bei dem die EBs an den arrays automatisiert aufgenommen und gemessen wurden, konnte der antiproliferative Effekt von RA während der EB-Entwicklung dargestellt werden. Unter Verwendung des drop array-Systems konnte die RA-induzierte neuronale Differenzierung für die Entwicklung eines neuen neuronalen Differenzierungsprotokolls genutzt werden, bei dem die EB-Erzeugung und die neuronale Induktion in einem Schritt durchgeführt wurde. Es wurde ein Protokoll zur Isolierung von Zellkernen angewandt, das eine Proteomanalyse des Nukleus ermöglichte, bei der Proteine detektiert wurden, die durch eine RA-Behandlung reguliert werden. Darunter der nukleäre Nachweis des aktivierten CRABP1, sowie von Faktoren die an der RNA-Prozessierung und DNA-Modifikation beteiligt sind. Ein direkter RA-abhängiger Effekt ist die Induktion des Lamin A Filamentes. Es konnten zahlreiche Proteine detektiert werden, die den antiproliferativen und proapoptotische Effekt von RA unterstreichen. Darunter das Tumorsuppressor Protein TIS, das die Translationsinitiation inhibiert und durch eine RA-Behandlung verstärkt synthetisiert wurde. Einige Proteine sind proteolytisch degradiert, wie das CAD-Protein, das Caspase Schnittstellen besitzt, sowie die RNA- Helicase p68. Die RA-Behandlung von EBs reduzierte die nukleäre Menge des Nucleophosmin-Pools und verstärkte die autokatalytische Degradation von Nucleolin. Beide sind multifunktionelle Proteine, die an der Ribosomen–Biogenese involviert sind und einen entscheidenden Einfluss auf die Regulation der Proliferation besitzen. Die in dieser Arbeit angewandten und weiterentwickelten Verfahren leisten einen Beitrag zur Verbesserung der Analyse von embryonalen Stammzellen.

Abstract:

A major goal of stem cell research is the use of pluripotent stem cells for tissue engineering. This thesis describes novel methods for murine embryonic stem cell (ESC) differentiation, which were used for the analysis of early differentiation processes, as well as for the differentiation of specific cell types. Differentiation of ESCs was induced by forming ESC aggregates as embryoid bodies (EB) on drop arrays (DA). This novel tool (Kammer, patented) has been designed to produce homogeneous EBs in mass culture (several thousand). Utilization of the drop array system allowed the establishment of several other applications. Among them a visual recording system (live imaging system) that was used for time-elapsed recording of early hematopoietic differentiation processes during EB development. These observed hematopoietic precursors were isolated and further differentiated to hematopoietic cells of the myeloid lineage, as well as of mast cell populations. Additionally this study elucidates time and concentration dependent effects of the morphogen retinoic acid (RA) during ESC differentiation. Initially, cytotoxic and proliferative effects of RA were investigated with an established EB-documentation system that allowed automated recording and measuring of EB areas on drop arrays. Obtained results of this analysis underlined the anti-proliferative effect of RA during EB-differentiation. In addition, the drop array system was suitable for development of a new neural differentiation protocol that allowed EB-production and RA-induced neural induction in one step. Furthermore, a proteomic approach allowed the detection of nuclear proteins that were regulated during RA-treatment. Nuclear translocation of RA activated CRABP1 was confirmed by an established protocol for cell nuclei isolation. Predominant identified factors are involved in RNA processing and DNA modification. Some identified proteins contain RA receptor response elements in their promoter regions, e.g. the induction of the Lamin A filament synthesis is direct induced by RA-treatment during ESC differentiation. Several other proteins could have been detected that emphasis the anti-proliferative and pro-apoptotic effects of RA. Among them the tumour suppressor protein TIS, that inhibits the translation initiation and which synthesis is decreased by RA treatment. Some proteins are proteolytic degraded, e.g. the CAD protein which has caspase cleavage sites, as well as RNA helicase p68. RA-treatment of EBs reduces the amount of nuclear Nucleophosmin, as well as increases the degradation of the autocatalytic activity of Nucleolin. Both are multifunctional proteins, involved in ribosome biogenesis and have a decisive influence on the regulation of proliferation. In conclusion, the applied and developed procedures contribute to the improvement of embryonic stem cell research.

This item appears in the following Collection(s)