Lentiviral vector-mediated gene transfer to ependymal cells in primary culture

DSpace Repository


Dateien:
Aufrufstatistik

URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-34959
http://hdl.handle.net/10900/43894
Dokumentart: Dissertation
Date: 2008
Language: English
Faculty: 8 Zentrale, interfakultäre und fakultätsübergreifende Einrichtungen
Department: Interfakultäres Institut für Biochemie (IFIB)
Advisor: Hamprecht, Bernd (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2008-07-04
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: Ependymine , Cilie
Other Keywords:
Ependyma , Kinocilia , Lentivital vectors , Cell-specific promoters
License: Publishing license including print on demand
Order a printed copy: Print-on-Demand
Show full item record

Inhaltszusammenfassung:

Kinocilien sind bewegliche Zellanhänge, die aus Ausstülpungen der apikalen Plasmamembran polarer Zellen hervorgehen. Ihre Beweglichkeit entspringt einem als Axonem bezeichneten, komplizierten mikrotubulären Cytoskelettelement. Die einzigen Kinocilien tragenden Zellen des Gehirns sind die Ependymzellen, welche die Wände der flüssigkeitsgefüllten cerebralen Ventrikel auskleiden. Ependym-reiche Primärkulturen sind ein wichtiges Modellsystem zur Erforschung des Ependyms. In der Vergangenheit wurde der Wert dieses Modells allerdings dadurch reduziert, dass die kultivierten Zellen gegenüber den meisten Methoden des Gentransfers resistent sind. Auch in der vorliegenden Arbeit konnte mit Plasmid-basierten Verfahren die Transfektionseffizienz nicht über 1% gesteigert werden, und die Transfektion Kinocilien tragender Zellen wurde nie beobachtet. Obwohl Ependymzellen in vivo leicht von Viren infiziert werden, führte die Exposition ependymaler Primärkulturen gegenüber einem mit VSV-G-Hüllprotein pseudotypisierten Vektor, der GFP unter der Kontrolle des ubiquitär aktiven EF1alpha-Promotors enthielt, nur zur Transgen-Expression in weniger als 5% der Kinocilien tragenden Zellen. Diese Behandlung halbierte darüber hinaus die Gesamtzahl kinociliierter Zellen um 50%, ohne dass der Apoptoseinhibitor NS3694 das verhindern konnte. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung der Kulturen mit einem gleichermaßen pseudotypisierten Vektor, bei dem GFP unter der Kontrolle des mit Kinocilien assoziierten FOXJ1-Promotors steht, zur Transgenexpression in >60% der Kinocilien tragenden Zellen und hatte keine negativen Auswirkungen auf deren Gesamtzahl. Wenn der FOXJ1-Promotor durch denjenigen des kürzlich entdeckten, für Kinocilien tragende Zellen spezifischen Gens WDR16 ersetzt wurde, konnte sogar in >75% aller Kinocilien tragenden Zellen GFP-Expression beobachtet werden. Zusammenfassend ermöglicht der Einsatz von Promotoren, die nur in Kinocilien tragenden Zellen aktiv sind, effizienten lentiviralen Gentransfer in primäre Ependymzellen und erweitert dadurch den Anwendungsbereich dieses Modellsystems deutlich.

Abstract:

Kinocilia are motile cell appendages formed from evaginations of the apical plasma membrane of polarized cells. Their motility originates from an elaborate microtubular cytoskeletal element called the axoneme. The only kinocilia-bearing cells of the brain are the ependymal cells which line the surfaces of the fluid-filled cerebral ventricles. Ependymal primary cultures are an important model system to study the properties of these cells. In the past, the value of the model was, however, reduced by the resistance of the cultured cells to most gene transfer methods. Also in this study, transfection of ependymal cells in primary culture with different plasmid-based transfection methods did not result in the transfection of any kinociliated cells, and the total transfection efficiency was always below 1%. Even though the kinociliated ependyma is easily transduced by lentiviral vectors in vivo, exposure of ependymal primary cultures to lentiviral vectors pseudotyped with VSV-G envelope and bearing GFP as a marker under the control of the ubiquitously activated EF1alpha promoter lead to transgene expression in less than 5% of the kinocilia-bearing cells. This treatment also had a deleterious effect on the cultures, reducing the total number of kinociliated cells present by 50% in a way not preventable by the apoptosis inhibitor NS3694. In contrast, exposure of the cell cultures to equally pseudotyped lentiviral vector bearing GFP under the control of the kinocilia-associated FOXJ1 promoter lead to transgene expression in >60% of the kinocilia-bearing cells and did not negatively affect the cell cultures. When the FOXJ1 promoter was replaced by the promoter of WDR16, a recently discovered gene specifically expressed in kinocilia-bearing cells, transgene expression was even observed in >75% of all kinociliated cells. In summary, the use of promoters specifically recognized in kinocilia-bearing cells permits efficient lentiviral gene transfer to ependymal cells in primary culture, greatly enhancing the applicability of the culture system as a model of the ependyma.

This item appears in the following Collection(s)