HLA-Ligandom- und Expressions-Analyse von Tumor- und Autophagie-assoziierten Antigenen in soliden Tumoren und Zelllinien

Abstract

Die Erkennung maligner Zellen durch T-Zellen beruht auf HLA-präsentierten Peptiden. Im Kontext der Auswahl von Impfpeptiden zur Immuntherapie des Nierenzellkarzinoms (RCC) wurde in dieser Arbeit ein komplexer Ansatz angewandt: Zielsetzung dieser Arbeit die Charakterisierung des HLA-Ligandoms von RCC mittels massenspektrometrischer Peptidsequenzierung und die Analyse zugrundeliegender Quellproteine aufgrund von Mikroarray-basierten Gen- und Proteinexpressionsanalysen. Es ergaben sich zwei Einteilungen der 1675 identifizierten HLA-Liganden und ihrer 1053 Quellproteine. Zum einen die der Gewebespezifität - es konnten Peptide identifiziert werden, die nur auf RCC- oder nur auf Primärgewebe präsentiert wurden, und solche, die universell auf diversen Geweben und Zelltypen vorkommen. Unter diesen drei Gruppen wurde im Hinblick auf die Immuntherapie eine weitere Einteilung in abundante Selbstproteine, potentielle und etablierte Tumorantigene getroffen. Desweiteren wurden in einer Reihe von RCC-Geweben von ausgewählten Tumorantigenen Expressionsanalysen mit der Technologie Mikroarray-basierter Proteinexpressionsanalysen durchgeführt. Diese moderne Technologie befindet sich zwar noch im Stadium der Etablierung, liefert aber schon jetzt vielversprechende Ergebnisse vor allem bei der Suche nach Biomarkern. Die hier erzielten Daten der Proteinexpression zeigten, dass weder eine Korrelation mit Daten zur RNA-Expression der entsprechenden Tumorantigene vorliegt noch ergaben sie aufgrund ihrer Expressionsprofile einen Hinweis auf eine allgemein RCC-spezifische Hochregulation der Proteinexpression. Die Analysen verdeutlichten insgesamt die starken Unterschiede der Informationen, die aus Analysen des HLA-Ligandoms, Gen- und Proteinexpressionen gewonnen werden. Unter den identifizierten Tumorantigenen fanden sich einige hoffnungsvolle Kandidaten für die Immuntherapie in der Gruppe der im Rahmen dieser Dissertation analysierten Gewebe, so zum Beispiel verschiedene Liganden aus dem bereits bekannten Tumorantigen Adipophilin, aus insulin-like growth factor binding protein 3 sogar HLA Klasse I- und Klasse II-Liganden oder ein Ligand aus dem potentiellen Tumorantigen Plexin B2. Mit Hilfe der Liganden-basierten Quellproteinanalyse wurde eine spezifische, Patienten-individuelle Tumoranalytik durchgeführt, so dass eine Vakzinierung optimal auf die Patienten-eigene Tumorbiologie zugeschnitten werden konnte. Andererseits verhalf die Analyse des gesamten RCC-Ligandoms zur Auswahl bekannter Tumorantigene in solchen Fällen, in denen bei der Liganden-basierten Quellproteinanalyse keine geeigneten patienten-individuellen Impfkandidaten identifiziert werden konnten. Der zweite Abschnitt dieser Dissertation untersuchte verschiedene durch Autophagie-Induktion beeinflusste Phänomene. Neben der Untersuchung verschiedener Nachweisverfahren wurden Mikroarray-basierte Proteinexpressionsanalysen sowohl Autophagie-assoziierter Antigene als auch von Proliferationsmarkern und Tumorantigenen durchgeführt. Das Hauptinteresse lag auf der HLA-Ligandenanalyse der 186 HLA-Liganden aus Kontrollzellen im Vergleich zu 403 HLA-Liganden Autophagie-behandelter Zellen. Im Kontext der Onkogenese und Krebstherapie sind die beobachteten Effekte insofern von Interesse, als die Behandlung von Zellen mit Mangelmedium zumindest teilweise eine Situation widerspiegelt, die der von Tumorzellen im Gewebeverband entspricht, bevor verstärkte Angiogenese ein genau gegenteiliges Verhältnis aufbaut. Die Effekte einer Rapamycin-Behandlung entsprechen denen, die durch immer häufiger angewandte Tumortherapie mit Temsirolimus (Rapamycin) ausgelöst und noch lange nicht abschließend untersucht worden sind. Ob die beobachteten Phänomene jedoch auf einer Autophagie-Induktion oder -Assoziation beruhen, konnte in den hier zugrundeliegenden Experimenten nicht eindeutig geklärt werden.

Recognition of malignant cells by T cells is based on HLA-presented peptides. In the context of the selection of vaccination peptides for the immunotherapy of renal cell carcinomas (RCC) this work used a complex approach: Goal of this work was the characterisation of the HLA ligandome of RCC by mass spectrometry-based peptide sequencing together with the analysis of the respective source proteins via microarray-based gene and protein expression analyses. The investigations of the 1675 identified HLA ligands and their 1053 source proteins resulted in two sorts of classification. Identified peptides could be classified by their tissue specificity: some were only presented on RCC or on primary tissues, others had been found on several different tissues and cell types. Among these three groups another classification was made according to their usability in immunotherapy: peptides from abundant self proteins, from potential or established tumor antigens. Besides, expression analyses of selected tumor antigens were made in a number of RCC tissues using the technology of microarray-based expression analysis. This modern technology is still in the state of establishment. But it already offers promising results in the search of biomarkers. Expression data showed neither a correlation between protein and RNA expression of the respective tumor antigens nor did the expression profiles point at a RCC-specific upregulation of the protein expression. The analyses made clear that there is a strong divergence among the informations gained from analyses of the HLA-ligand presentation, gene and protein expression. Among the identified tumor antigens some promising candidates for immunotherapy could be detected on the tissues examined within this work. For example, there were several ligands from the established tumor antigen adipophilin, even some HLA class I and class II ligands from insulin-like growth factor binding protein 3 and a ligand from the potential tumor antigen plexin B2. Using a ligand-based analysis of source proteins specific patient-individual tumor analyses were performed so that vaccinations could be tailored to the patient-individual tumor biology. Next to that, analyses of the entire RCC ligandome helped in the selection of known tumor antigens in cases where no patient-individual vaccination candidates could be found via ligand-based analyses. The second part of this work investigated different autophagy-related phenomena. Next to the investigation of different techniques of proof micoarray-based protein expression analyses of autophagy-related antigens as well as of proliferation markers and tumor antigens were carried out. Main objective of this part was the analysis of the HLA ligandome of 186 HLA ligands from controll cells compared to 403 HLA ligands from autophagy-treated cells. The observed effects are of interest especially in the context of oncogenesis and cancer therapy since treating the cells with depletion media resembles partly the situation of tumor cells in the state before angiogenesis induces opposite effects. Treatment with rapamycin matches the effects caused by tumor therapy with temsirolimus (rapamycin) which is applied more and more often but has not been investigated concludingly. Whether the observed phenomena are due to autophagy induction or association could not be clarified completely in this work.