Das Siderophor-Antibiotikum Salmycin - Studien zu Wirkspektrum, Aufnahmemechanismus, Resistenzbildung und in-vivo-Wirksamkeit

Abstract

In dieser Arbeit wurde das Antibiotikum Salmycin untersucht, welches zur Substanzklasse der Sideromycine zählt. Im Verlauf der Untersuchungen wurden die Fermentationsparameter für Salmycin untersucht. Verglichen wurden Syntheseverlauf und Salmycinausbeute bei Fermentation in Komplexmedium und definiertem Produktionsmedium, Ein Protokoll zur Salmycinaufreinigung im mittleren Produktionsmaßstab wurde erstellt.

Des Weiteren wurde das Wirkspektrum von Salmycin anhand relevanter Pathogene erfasst und die minimale Hemmkonzentration sensitiver Keime bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass Salmycin ein sehr eng begrenztes Wirkspektrum besitzt und insbesondere Staphylokokken hochsensitiv gegen das Sideromycin sind.

Es konnte nachgewiesen werden, dass Salmycin aufgrund seiner Strukturähnlichkeit über das Ferrioxamintransportsystem in die bakterielle Zelle geschleust wird. Ein Schwerpunkt der Arbeit bildete die Untersuchung des Aufnahmesystems von Staphylococcus aureus. Die Sequenzierung resistenter Keime ergab Punktmutationen im Transmembrankomplex. Das Lipobindeprotein FhuD2 wies sich als relevant für die Erkennung von Salmycin. Auch der Fragestellung, weshalb die meisten Gram-negativen Bakterien keine Sensitivität zeigen wurde nachgegangen. Hierbei ergab sich, dass die äußere Membran eine wirksame Barriere darstellt und von Salmycin nur mittels eines spezifischen Transportproteins überwunden werden kann. Allerdings scheint noch ein zweiter Schutzmechanismus bei Gram-negativen Mikroorganismen eine Rolle zu spielen. Es wird vermutet, dass Enzyme des Cytoplasmas eine Inaktivierung des Antibiotikums bewirken.

Zuletzt wurde untersucht, inwieweit eine klinische Anwendung von Salmycin in Frage käme. Hierzu wurde die Zytotoxizität der Substanz über LDH-Assay geprüft und ein Maus-Infektionsmodell für Staphylococcus aureus entwickelt. Es konnte nachgewiesen werden, dass Salmycin bei physiologischem pH-Wert eine kurze Halbwertszeit besitzt und in-vivo nur geringe Wirksamkeit zeigt.

In this work the parameter of Salmycin overproduction was compared in complex and defined production media. Mid-scale fermentation was carried out and a protocol for Salmycin purification by chromatography techniques was developed.

The activity spectre of Salmycin against common bacterial pathogens was determined. It has been shown that Salmycin activity covers only a narrow range of bacteria including Gram positive and few Gram negative pathogens. Focus was led within the species Staphylococcus aureus which showed the highest susceptibility. The MIC of relevant sensitive pathogens was determined using broth microdilution assays.

The examination of spontaneous occurring resistant colonies performing plate assays, transport assays and sequencing verified the correlation of Salmycin sensitivity and ferrioxamine uptake. In Staphylococcus mutants the FhuCBG transport system was identified as responsible for the transport of Salmycin into the cytoplasm. Mutations identified within the membrane complex lead to complete loss of transport and cross resistance to both Albomycin and Salmycin. One mutation found in the binding lipoprotein FhuD2 leads to the conclusion that it plays a vital role in Sideromycine recognition. A homologue situation has been shown in the species Bacillus subtilis. Results indicate that Gram negative bacteria have an additional mechanism of resistance not dependent on the Siderophore uptake system. It has been assumed that the observed resistance of Gram negative bacteria is originated in metabolic processes within the Periplasma like enzymatic cleavage.

Finally, the clinical relevance of Salmycin as an antibiotic drug was examined. Cytotoxicity of the Sideromycine was determined by LDH assay on Hep2 cells which showed only minor effects. Experiments carried out using mice infected with MRSA led to the conclusion that Salmycin seems to be less effective in-vivo presumably because of its structure and stability at physiological pH.