Efficient in vitro priming of tumor- and virus-specific CD8+ T cells with calibrated artifical APCs

Abstract

T cells are important effectors in the defense of human pathogens entering the organism. CD8+ T cells recognize peptides which are presented by MHC class I molecules and lyse cells which are infected by viruses or intracellular pathogens. One aim of this thesis was the development of a fast and reproducible method to prime and expand functional antigen-specific CD8+ effector T cells. We used the modified HLA-A*0201 restricted epitope ELAGIGILTV as a model system. Priming experiments were performed using artificial antigen presenting cells with defined MHC densities. Different settings for coating aAPCs had to be tested until we came up with an optimized ratio of 3:1 for costimuatory antibodies anti-4-1BB and anti-CD28, which enabled in vitro priming of high- or low-avidity effector T cells. To further characterize the T cell responses, we used fluorescently labeled MHC I tetramers as well as intracellular cytokine staining and 51Cr release assay. Induced CTLs were of an effector memory phenotype and therefore fully functional. Repeated stimulation of CD8-enriched T cells of different donors pointed out that on average a fivefold higher percentage of tetramer-specific T cells could be obtained by costimulation with anti-4-1BB/anti-CD28 in a 3:1 ratio if, compared to anti-CD28 alone. The optimal ratio between anti-CD28 and anti-4-1BB, values of up to 72% of antigen-specific T cells were monitored. Similar results could be obtained for the HLA-A*0201 restricted epitope SLAPPVHNV referred to tetramer staining. T cells specific for this altered peptide ligand recognize the cognate peptide SLAPPVHNV derived from the tumor antigen MUC1. HCMV infection is a major cause of death and disease in immunocompromised patients, especially organ transplant recipients, haemodialysis patients, cancer patients, people receiving immunosuppressive drugs and HIV-patients. Therefore, it is of utmost remaining interest to research for innovative approaches to generate antigen-specific T cells. The developed artificial priming method was highly effective in priming and expanding HCMV-specific CD8+ T cells from freshly isolated CD8+ T cells from HCVM inexperienced healthy donors. As expected the induced effector T cells were capable of lysing target cells efficiently and secreted INF-gamma. The efficiency of such a highly controlled T cell stimulation system holds great promisefor future therapeutic settings.

T-Zellen sind wichtige Effektoren bei der Abwehr von Krankheitserregern im menschlichen Organismus. CD8+ T-Zellen erkennen Peptide, die von MHC-Klasse I-Molekülen präsentiert werden und zerstören Zellen, die durch Viren oder intrazelluläre Erreger infiziert sind. Die vorgelegte Arbeit hatte zum Ziel, eine Methode zu entwickeln, mit der es möglich ist schnell und reproduzierbar CD8+ T-Zellen gegen tumorassozierte Antigene zu induzieren und diese zu expandieren. Als Modellsystem wurde das veränderte HLA-A*0201 restringierte Epitop ELAGIGILTV, das vom Tumorantigen MelanA/Mart1 abstammt, genutzt. Priming-Experimente wurden mit Hilfe von Antigen-präsentierende Zellen mit kontrollierter MHC-Beladung durchgeführt. Es mussten verschiedene Beladungsstrategien für die künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen ausgetestet werden, bis schließlich das optimale Verhältnis an kostimulatorischen Antikörpern von 3:1 (anti-4-1BB zu anti-CD28) ermittelt werden konnte. Mit dieser Kombination war es möglich in vitro gezielt hoch- oder niedrig-avide Effektor-T-Zellen zu generieren. Um die Funktionalität der T-Zellantworten näher zu beschreiben wurden Tetramerfärbungen, intrazelluläre Zytokinfärbungen und 51Chrom-Freisetzungstests durchgeführt. Die erzeugten T-Zellen wiesen einen Effektor-Phänotyp auf und waren voll funktionstüchtig. Durch wiederholte Stimulationsversuche mit T-Zellen verschiedener Spender konnte gezeigt werden, dass 5-fach größere Tetramer-spezifsche T-Zellpopulationen mit einer 3:1-Kombination der kostimulatorischen Antikörper, im Vergleich zu anti-CD28 alleine, erzielt werden konnten. Außerdem konnten nach Stimulation T-Zellpopulationen mit bis zu 72% Tetramer-spezifischer T-Zellen damit erhalten werden. Ähnliche Ergebnisse konnten auch mit dem HLA-A*0201 restringierten Epitop SLAPPVHNV beobachtet werden, auch wenn hier noch die funktionalen Tests ausstehen. Die Infektion mit dem Humanen Cytomegalievirus (HCMV) ist eine der Hauptursachen für den Tod bzw. schwere Krankheitsverläufe, bei immunsupprimierten Patienten. Daher ist es immer noch von dringender Notwendigkeit, innovative Ansätze zur Generierung von Antigenspezifischen T-Zellen in großer Zahl zu entwickeln. Die zuvor beschriebene Priming Methode war auch bei der Induktion und Expansion von HCMV-spezifischen CD8+ T-Zellen, die zuvor aus Virus-unerfahrenen gesunden Spender isoliert wurden, sehr effektiv. Die induzierten Zellen wiesen wie erwartet eine Effektorfunktion auf. Das hohe Maß an Effizienz und Kontrolle dieses Systems könnte sich bei zukünftigen immuntherpeutischen Anwendungen auszahlen.