New approaches in tumour immunology: Implications from mass spectrometric analyses of HLA-ligands

Abstract

Molecularly defined approaches in tumour immunotherapy require the identifi- cation of appropriate tumour (associated) antigens. Therefore, a quantitative mass spectrometric approach based on the differential N-terminal isotope coding (dNIC) strategy was chosen for analysis of various HLA-bound peptide pools. In a first step, we could show that the systemic variations in the dNIC approach are low enough that biological differences in two samples can be detected reliably. In a TAP-deficient cell line we have identified several over-presented peptides, which share some common features: Most of these peptides had a reduced binding affinity to MHC-I molecules and were derived from signal sequences. However, several of the TAP-independently presented peptides were presumably generated by the proteasome and transported into the ER via alternative pathways. Using primary tumour tissue and autologous normal tissue, we were able to show that the correlation of over-presented peptides to their corresponding mRNA levels was very weak. This result emphasized the importance of quantitative MHC ligand analysis for a fast and reliable identification of tumour (associated) antigens. Finally, we took an HLA ligand which was identified as being majorly overpresented in our tumour vs. normal tissue comparison and demonstrated that this VEGF-derived ligand can be used as a CTL epitope derived from the tumour associated antigen VEGF. Concluding, the dNIC strategy is a powerful MS-based approach for the identi- fication of differences in the HLA ligandome of two samples. This can be utilised for a broad spectrum of applications ranging from quantitative HLA ligandome comparisons to the identification of tumour associated CTL epitopes.

Molekular definierte Ansätze in der Tumorimmuntherapie setzen die Identifikation geeigneter Tumor (assoziierter) Antigene voraus. Deshalb wurde ein massenspektrometrischer Ansatz, basierend auf der differentiellen N-terminalen Isotopencodierungs (dNIC) Strategie, gewählt um diverse Vergleiche von HLA-gebundenen Peptidpools durchzuführen. In einem ersten Schritt konnten wir zeigen, dass die systemischen Variationen der dNIC-Methode klein genug sind, um biologische Unterschiede zwischen zwei Proben verlässlich zu identifizieren. In einer TAP-defizienten Zelllinie konnten wir mehrere überpräsentierte Peptide identifizieren, die einige Gemeinsamkeiten teilten: Die meisten dieser Peptide hatten eine verminderte Bindungsaffinität zu MHC-I Molekülen und kamen aus Signalsequenzen. Einige der TAP-unabhängig präsentierten Peptide wurden jedoch wahrscheinlich durch das Proteasom erzeugt und gelangten durch einen alternativen Weg in das ER. Bei einem Vergleich von Tumor- und autologem Normalgewebe konnten wir zeigen, dass die Korrelation von überpräsentierten Peptiden mit ihren korrespondierenden mRNA-Verhältnissen nur sehr gering war. Dieses Ergebnis betont die Bedeutung der quantitativen MHC-Ligandenanalyse für eine schnelle und verlässliche Identifizierung von Tumor (assoziierten) Antigenen. Zuletzt verwendeten wir einen HLA-Liganden, der in unserem Tumor versus Normalgewebsvergleich als besonders überpräsentiert identifiziert wurde. Für diesen Liganden aus VEGF konnten wir zeigen, dass er als CTL-Epitop des Tumor-assoziierten Antigens VEGF verwendet werden kann. Schlussfolgernd betrachtet ist die dNIC-Strategie ein MS-basierter Ansatz mit großem Potential für die Identifizierung von Unterschieden im HLA-Ligandom von zwei Proben. Dies kann für ein breites Anwendungsspektrum eingesetzt werden, welches von den quantitativen HLA-Ligandomanalysen bis hin zur Identifizierung von Tumor-assoziierten Antigenen reicht.