Identifikation und Charakterisierung der Dopamin-Rezeptoren des Flohs Ctenocephalides felis

Abstract

Für die Identifikation und Klonierung der ersten GPCRs des Flohs C. felis wurde zunächst eine bioinformatische Analyse durchgeführt. Das Genom des Flohs ist bisher nicht sequenziert worden. Deshalb müssen neue Gene mittels degenerierter PCR identifiziert werden, eine Methode, die auf der Konservierung zwischen bekannten Orthologen und dem gesuchten Gen basiert. Dabei korreliert der Grad der Konservierung mit der Wahrscheinlichkeit, die Gene erfolgreich identifizieren zu können. Mit Hilfe der bioinformatischen Analyse wurden die Insekten-GPCRs mit der höchsten Konservierung bestimmt: die Familie der Dopamin-Rezeptoren. Die Sequenzen der Dopamin-Rezeptoren I, II und III des Flohs wurden anschließend in degenerierten nested und RACE-PCR-Ansätzen ermittelt. Aufgrund von Sequenzvergleichen wurden die Rezeptoren eingeordnet und klassifiziert und entsprechend als CfDopRI, II (D1-ähnlich) und III (D2-ähnlich) benannt.

Um die Funktionalität der neuen Gene überprüfen zu können, wurde zuerst die längste Variante des CfDopRII in Oozyten des Krallenfroschs X. laevis exprimiert. Es zeigte sich, dass dieser Rezeptor bei Stimulation mit Dopamin einen Anstieg des intrazellulären cAMP-Spiegels vermittelt. Dieses Ergebnis konnte in HEK293-Zellen bestätigt werden. Der EC50 des CfDopRII wurde bestimmt und beträgt 2,4 µM Dopamin. Eine Auswahl an biogenen Aminen wurde hinsichtlich ihrer agonistischen Wirkung auf den CfDopRII untersucht. Im Vergleich führte die Inkubation mit Dopamin eindeutig zum höchsten Anstieg des intrazellulären cAMP-Spiegels. Der CfDopRI wurde ebenfalls funktionell in HEK293-Zellen exprimiert und sein EC50 beträgt 0,12 µM Dopamin. Auch hier führte die Stimulation mit Dopamin im Vergleich zu Tyramin, Octopamin und Serotonin zur höchsten Antwort in Form der Erhö¬hung des cAMP-Spiegels der HEK293-Zellen. Der nachgewiesene cAMP-Anstieg in Abhängigkeit von der Aktivierung des CfDopRI und II bestätigt die Klassifizierung der Rezeptoren als D1-ähnliche Dopamin-Rezeptoren auch auf funktioneller Ebene.

Mit Hilfe des Modell-Organismus D. melanogaster wurde die funktionelle Bedeutung der Dopamin-Rezeptoren für die Fruchtfliege untersucht. Die Rezeptoren DmDopRI, II und III verursachten bei einem knock-down durch RNAi Letalitätsraten, die zwischen der negativ Kontrolle (knock-down der Expression des white-Gens) und der positiv Kontrolle (knock-down der Expression des Phosphofructokinase-Gens) lagen. Die reduzierte Lebensfähigkeit zeigte, dass ein Funktionsverlust der Dopamin-Rezeptoren physiologische Konsequenzen für die Fliegen hat. Allerdings ist der knock-down der Dopamin-Rezeptoren nicht im gleichen Maße essentiell, wie z.B. der knock-down der positiv Kontrolle. Eine vergleichbare Bedeutung wird für das Insekt C. felis erwartet.

Im Rahmen einer chemoinformatischen Analyse wurde ein dreidimensionales Modell des CfDopRI erstellt. Es wurde bestätigt, dass der bereits beschrie¬bene Antagonist SCH23390 mit Spezifität für D1-ähnliche Rezeptoren auch biologische Aktivität auf dem Dopamin Rezeptor I von C. felis besitzt. Mit einem Pharmakophor-Modell dieses Antagonisten in Verbindung mit der Rezeptor-Struktur des CfDopRI wurden neue Substanzen in silico gesucht, die anschließend in der Zellkultur getestet wurden. So konnte aus einer Substanz-Bibliothek mit 4,2 Millionen Einträgen eine neue Substanz mit antagonistischer Wirkung auf den CfDopRI identifiziert werden.

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent a protein family having a wide range of functions. Around 30% of human drug targets are GPCRs, illustrating their pharmaceutical importance. In contrast the knowledge about invertebrate GPCRs is limited and is mainly restricted to model organisms like Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans. Especially in ectoparasites like ticks and fleas, only a few GPCRs are characterised. From the cat flea Ctenocephalides felis, a relevant parasite of cats and dogs, no GPCRs are yet known. Thus a bioinformatic analysis of available insect GPCR sequences from the honeybee Apis mellifera, the mosquito Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster and genomic sequences was performed in order to identify GPCRs of highest conservation throughout insects and to clone orthologous genes of these candidates from Ctenocephalides felis. It was found that the complete dopamine receptor family revealed high conservation levels. The new genes CfDopRI, II and III were identified using degenerate nested PCR and RACE-PCR. The classification was performed by sequence comparisons like BLAST. Subsequently the functionality of the receptors should be tested. First CfDopRII was functionally expressed in oocytes of Xenopus laevis. Additionally the both receptors CfDopRI and CfDopRII were functionally expressed in HEK293-cells and characterised in detail. The function of the dopamine receptors from the model organism Drosophila melanogaster (DmDopRI, II and III) was investigated in vivo. For this approach transgenic RNAi flies were established. The lethality caused by the RNAi knock-down of specific genes was quantified. A positive control (knock-down of phosphofructokinase) and a negative control (knock-down of white) were used for the validation of the system. The knock-down of the three dopamine receptors DmDopRI, II and III resulted in an intermediate lethality between the positive and negative control. Furthermore a three dimensional model of the CfDopRI and a pharmacophore model of the antagonist SCH23390 were calculated. The two models were used to screen a virtual compound library with about 4.2 million entries. The selected 18 substances were analyzed in the in vitro assay. One of these compounds had an antagonistic effect on the receptor CfDopRI.