Evolution von Double psi beta-barrel Proteinen und Aspartatproteasen

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Zitierfähiger Link (URI): http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-25434
http://hdl.handle.net/10900/43858
Dokumentart: Dissertation
Erscheinungsdatum: 2006
Sprache: Deutsch
Fakultät: 8 Zentrale, interfakultäre und fakultätsübergreifende Einrichtungen
Fachbereich: Interfakultäres Institut für Biochemie (IFIB)
Gutachter: Lupas, Andrei
Tag der mündl. Prüfung: 2006-11-02
DDC-Klassifikation: 570 - Biowissenschaften, Biologie
Schlagworte: Aspartatproteasen
Freie Schlagwörter: Proteinevolution , RIFT-barrel , HAMP , Double psi beta-barrel
aspartic proteases , protein evolution , RIFT-barrel , HAMP , double psi beta-barrel
Lizenz: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ohne_pod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

In drei Schwerpunkten wurde die Evolution der Double psi beta-barrel Proteine und Aspartatproteasen untersucht. Im ersten Schwerpunkt ging es um die Faltungen Double psi beta-barrel, deren Vertreter als N-terminale Domänen von AAA-ATPasen wie Vat oder Cdc48 vorkommen, und Acid proteases, zu der die Aspartatproteasen Pepsin und HIV-1 Protease gehören. Obwohl die Strukturen dieser Faltungen bereits als sehr ähnlich erkannt und beschrieben wurden, werden sie bisher als analoge Strukturen mit konvergenter Evolution beschrieben. Dies stützte sich vor allem auf die fehlende Sequenzähnlichkeit und geringe Unterschiede der topologischen Verknüpfung ihrer beta-Stränge. In dieser Arbeit sollten funktionelle Untersuchungen Hinweise auf eine mögliche gemeinsame Abstammung dieser Faltungen liefern. Dazu wurden Chaperonassays durchgeführt, welche Aggregationsverhinderung als funktionelle Gemeinsamkeit von Vertretern dieser Faltungen offenbarten. Die Ergebnisse bestärkten die Vermutung, die Vertreter dieser Faltungen als entfernte Verwandte zu betrachten. Damit wurde ein weiteres Beispiel geliefert, wie sich eine Faltung durch divergente Evolution ändern kann und dies zu verwandten Proteinfaltungen führt. Ein zusätzlicher Aspekt in diesem Schwerpunkt war die Frage, ob es möglich sei, Domänen dieser Faltungen in ihrem Domänenkontext gegeneinander auszutauschen. Im zweiten Schwerpunkt wurde die Verwandtschaft der beiden Proteinfaltungen Double psi beta-barrel und Swapped hairpin-barrel untersucht. Die Verwandtschaft wurde aufgrund von markanten Strukturähnlichkeiten bereits vermutet. Die Sequenzähnlichkeit ist jedoch sehr gering und hinterließ Unsicherheit. Die Verwandtschaft dieser Faltungen wäre ein weiteres Beispiel für einen Faltungswechsel durch divergente Evolution. Der Hypothese über die homologen Faltungen fehlte jedoch ein plausibler Evolutionsmechanismus, der die Entstehung durch bekannte genetische Mechanismen beschreiben würde. In dieser Arbeit wurden die Strukturen der Proteine PhS018 und Af1504 untersucht. Durch Aufklärung der Struktur des Proteins PhS018 von Pyrococcus horikoshii konnte ein weitere, neue Faltung beschrieben werden: die Faltung RIFT-barrel. Sie steht intermediär zwischen Double psi beta-barrel und Swapped hairpin-barrel und kann die Entstehung dieser beiden Faltungen erklären. Darüber hinaus wurde durch Identifikation eines gemeinsamen, strukturell hoch konserviertes beta/alpha/beta-Elements die Evolution dieser Faltungen aus einfachen Supersekundärstrukturmotiven beschrieben werden. Neben PhS018 wurde das potentielle Double psi beta-barrel Protein Af1504 von Archaeoglobus fulgidus biochemisch untersucht. Im dritten Schwerpunkt wurde die Funktion eines Operons aus Archaeoglobus fulgidus untersucht. In diesem Operon wird das Protein Af1504 zusammen mit den Proteinen Af1502, Af1503 und Af1505 kodiert. Zum Operon gehört das Transmembranprotein Af1503, für das bereits eine cytoplasmatische HAMP Domäne vorhergesagt wurde, welche in prokaryontischen Signaltransduktionsproteinen weit verbreitet vorkommt. Die Struktur dieser HAMP Domäne sollte aufgeklärt werden, was durch NMR-Spektroskopie erstmalig bei einer HAMP-Domäne gelang. Die HAMP Domäne lag in einer coiled coil Konformation vor, die bisher noch nie bei einem nativen Protein beobachtet wurde: complementary x-da Konformation. Aus dieser Besonderheit konnte ein molekularer Signaltransduktionsmechanismus für prokaryontische Transmembranrezeptoren abgeleitet werden. Der Mechanismus basiert auf der Zahnradartigen Drehung von alpha-Helices. Ein weiterer Aspekt in diesem Schwerpunkt war, nach möglichen Liganden für die extraplasmatische Domäne von Af1503 zu suchen. Als Ergebnis wurde Calcium als potentieller Ligand identifiziert und die Interaktion wurde mit Kalorimetrie charakterisiert. Abschließend wurde eine mögliche funktionelle Interaktion der Proteine des Operons und eine Funktion des Operons für das Archaeum A. fulgidus vorgeschlagen und diskutiert.

Abstract:

In three parts the evolution of double psi beta-barrel proteins and aspartic proteases was analyzed. The first part was about the folds double psi beta-barrel to which representatives of N-terminal domains of AAA-ATPases like Vat or Cdc48 belong to, and acid proteases like the aspartic proteases pepsin and HIV-1 protease. Even though these folds have been recognized and described as structurally very similar they are regarded so far to be analogous with convergent development. These assumptions were based on the missing sequence similarity and differences in the connections of their beta-strands. This work suggests a common ancestry based on newly discovered functional similarities. Chaperone assays have been done for that which revealed the prevention of protein aggregation as a common trait. This supplies one more example in which folds changed in the course of divergent evolution. One additional aspect in this part was to examine if the domains of the different folds are interchangeable within their domain context. The second part dealt with the folds double psi bet-barrel and swapped hairpin-barrel. Homology of those has been suspected already due to characteristic structural similarities. However, a low sequence similarity could not support this notion clearly. This homology would be one more example of fold changes during evolution but a evolutionary mechanism had been missing. The structures of the proteins PhS018 from Pyrococcus horikoshii and Af1504 from Archaeoglobus fulgidus were the subject of this work. A new fold has been discovered by solving the solution structure of PhS018: the RIFT-barrels. This fold is intermediate between double psi bet-barrel and swapped hairpin-barrel and provides a plausible evolutionary mechanism for the development of these folds. Moreover, a structurally highly conserved beta/alpha/beta-element could be identified with which an evolutionary scenario from antecedent peptides made of supersecondary structure elements could be proposed. Besides PhS018, the potential double psi beta-barrel protein Af1504 was characterized biochemically. The third part dealt with the function of an operon from A. fulgidus. The protein Af1504 is encoded in it together with the proteins Af1502, Af1503 and Af1505. A HAMP-domain had already been predicted for the transmembrane protein Af1503, which are abundant domains in prokaryotic signal transduction proteins. As the first structure of a HAMP domain ever, the solution structure of the HAMP-domain from Af1503 was solved by NMR spectroscopy. The HAMP domain shows a coiled coil conformation that had never been observed before in a native protein: complementary x-da conformation. Out of this peculiarity, a molecular signal transduction mechanism could be suggested for prokaryotic transmembrane receptors. This mechanism bases on the cogwheel-like rotation of alpha-helices. Another aspect in this part was the search for potential ligands of Af1503. Calcium was suggested to be a ligand and its interaction with Af1503 was investigated and characterized by calorimetry. Finally, a functional interaction of the proteins of this operon and a function of this operon for the archaeon A. fulgidus has been proposed and discussed.

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