Characterization of Staphylococcus aureus peptidoglycan hydrolases and isolation of defined peptidoglycan structures

Abstract

Peptidoglycan (PG) hydrolases or autolysins are a group of enzymes which catalyze the degradation of bacterial cell wall at specific sites. Staphylococcus aureus produces two major PG hydrolases: major autolysin (Atl) and Aaa, a autolysin/ adhesin protein. The major autolysins of Staphylococcus aureus (AtlA) and of Staphylococcus epidermidis (AtlE) are well-studied enzymes. But little is known about the Aaa protein. To analyse the possible role of these PG hydrolases we constructed the atlA and aaa deletion mutants in S. aureus.

SA?atlA formed large cell clusters and was biofilm-negative owing to a deficiency in adherence to the indwelling device surface. In electron micrographs, the mutant cells were distinguished by a rough outer cell surface. A high proportion of abnormally formed multicells that were septated but not separated from each other were observed, which suggested hampered cell separation. Both atlA and atlE complemented the mutant.

The atl gene product is a bifunctional protein that has an N-terminal N-acetyl L-alanine amidase (Ami) domain, three internal repeat domains (R1, 2, 3) and a C- terminal endo-ß-N-acetylglucosaminidase (GL) domain which undergo proteolytic processing to generate the two extracellular lytic enzymes (62 kDa Ami-R1, 2 and 51 kDa R3-GL) found in the culture broth of S. aureus. In the mature protein repeats R1 and R2 are located at the C-terminal portion of the amidase (Ami-R1, 2) and repeat R3 is located at N-terminal portion of the glucosaminidase (R3-GL). To study the role of the repetitive sequences of atlE, we expressed in Escherichia coli the amidase domain encoded by the gene, carrying no repeat regions (amiE) or two repeat regions (amiE-R1, 2), or the three repeat regions alone (R1, 2, 3) as N-terminal His-tag fusion proteins. Only slight differences in the cell wall lytic activity between AmiE and AmiE-R1, 2 were observed. The repetitive sequences have a good binding affinity to isolated peptidoglycan and might contribute to the targeting of the amidase to the substrate. AmiE and AmiE-R1, 2 have a broad substrate specificity as shown by similar activities with peptidoglycan (PG) lacking wall teichoic acid, O-acetylation, or both. Since the amidase activity of AtlA and AtlE has not been proved biochemically, we used purified AmiE-R to determine the exact PG cleavage site. We provide the first evidence that the amidase indeed cleaves the amide bond between N-acetyl muramic acid and L-alanine.

SA?aaa mutant did not differ from the wild type in its colony morphology, growth rate, cell cluster and biofilm formation, suggesting that Aaa does not play a vital role in cell separation or, more probably, that the function of Aaa in cell separation may have been taken over by the major autolysin Atl, which seemed to be more strongly expressed in the aaa mutant than in the wild type. Autolysin/adhesin protein Aaa is a 35 kDa protein containing two direct LysM (lysine motif) repeats at the N-terminal and catalytic domain in the C-terminus. The C-terminal catalytic domain of Aaa is homologous to the CHAP (cysteine, histidine-dependent amidohydrolases/ peptidases) domain. This domain is often found in PG hydrolysing enzymes.

This work also established a purification method for isolation of soluble defined staphylococcal peptidoglycan fragments (PGs). Compared to earlier methods, which were based on using insoluble purified peptidoglycan, we standardize the purification method soluble PGs using HPLC. Commercially available mutanolysin and lysostaphin can be used to cleave PG structures. Apart from these two lytic enzymes, we biochemically characterized the amidase, which provides an alternative tool for PG analysis. Mutanolysin, lysostaphin and amidase can be used individually or together to isolate muropeptides, stem peptides or sugar residues for studying host cell signaling activities.

Peptidoglycanhydrolasen (PG-Hydrolasen) oder Autolysine sind eine Gruppe von Enzymen, die den Abbau der bakteriellen Zellwand an spezifischen Stellen katalysieren. Staphylococcus aureus produziert zwei Haupt-PG-Hydrolasen: das Hauptautolysin (Atl) und ein Autolysin/Adhäsin Protein (Aaa). Die Hauptautolysine von Staphylococcus aureus (AtlA) und Staphylococcus epidermidis (AtlE) sind gut untersuchte Enzyme. Über das Aaa Protein ist allerdings wenig bekannt. Um die mögliche Rolle dieser PG Hydrolasen zu analysieren konstruierten wir die Deletionsmutanten ?atlA und ?aaa in S. aureus

S.aureus ?atlA bildet große Zellanhäufungen und wächst nicht im Biofilm, was darauf zurückzuführen ist, dass die Zellen unfähig sind, an Oberflächen zu adhärieren. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte die Mutante eine raue Zelloberfläche. Des Weiteren fiel eine hohe Anzahl von anormal geformten Multizellen auf, die zwar septiert, aber nicht getrennt waren. Dies lässt auf eine verhinderte Trennung der Zellen schließen. Sowohl AtlA als auch AtlE komplementierten die Mutante S.aureus ?atlA.

Das atl Genprodukt ist ein bifunktionales Protein mit einer N-terminalen N-acetyl-L-Alanin Amidase (Ami), drei Repeatdomänen (R1, 2, 3), und einer C-terminalen endo-?-N-Acetyl-Glucosaminidase (GL), die einer proteolytischen Prozessierung unterzogen werden. Die zwei extrazellulären lytischen Enzyme (Ami-R1, 2 (62 kDa) und R3-GL51 (kDa)) können aus dem Kulturüberstand isoliert werden. Im prozessierten Protein befinden sich die Repeats R1 und R2 im C-terminalen Bereich der Amidase (Ami-R1, 2), der Repeat R3 ist im N-Terminalen Bereich der Glucosaminidase (R3-GL) lokalisiert. Um die Rolle der repetitiven Sequenzen von atlE zu untersuchen, exprimierten wir die Amidasedomäne ohne Repeats (amiE), mit zwei Repeatregionen (amiE-R1, 2) und die drei Repeatregionen (R1, 2, 3) alleine als N-terminale His-Tag Fusionsproteine. Zwischen AmiE und AmiE-R1, 2 waren nur geringe Unterschiede in der Zellwandlyse zu beobachten. Die repetitiven Sequenzen besitzen eine gute Bindeaffinität zu isoliertem Peptidoglycan und bewirken möglicherweise die Substratfindung der Amidase. AmiE und AmiE-R1, 2 besitzen eine breite Substratspezifität und zeigen vergleichbare Aktivität bei Peptidoglycan, dem entweder Wandteichonsäuren, O-Acetylierung oder beides fehlt. Da die Amidaseaktivität auf biochemischen Weg weder für AtlE noch für AtlA bestimmt wurde, verwendeten wir aufgereinigte AmiE-R1, 2, um die exakte Schnittstelle im Peptidoglycan herauszufinden. Wir liefern erste Belege, dass die Amidase tatsächlich die Amidbindung zwischen N-Acetylmuraminsäure und L-Alanin spaltet.

Die Mutante S.aureus ?aaa unterschied sich vom Wildtyp weder in Koloniemorphologie und Wachstumsrate, noch in Bildung von Zellanhäufungen und Biofilmen. Dies lässt die Vermutung zu, dass Aaa keine lebenswichtige Rolle bei der Zelltrennung besitzt. Wahrscheinlicher ist jedoch, dass die Funktion von Aaa vom Hauptautolysin Atl übernommen wird, welches in der Mutante stärker exprimiert wird als im Wildtyp. Das Autolysin/Adhäsin Protein Aaa ist ein 35kDa Protein, dessen N-terminale Domäne zwei direkte LysM (Lysin Motiv) Wiederholungen besitzt und dessen C-Terminus die katalytische Domäne darstellt. Die C-terminale Domäne von Aaa ist homolog zur CHAP (cysteine, histidine-dependent aminohydrolases/peptidases) Domäne, die oft in peptidoglycanhydrolysierenden Enzymen gefunden wird.

Weiterhin stellt diese Arbeit eine Methode zur Aufreinigung von löslichen Peptidoglycanfragmenten aus Staphylokokken vor. Verglichen mit früheren Methoden, die auf der Verwendung von unlöslichem aufgereinigtem Peptidoglycan basieren, nutzten wir die Aufreinigung von gelöstem Peptidoglycan via HPLC. Kommerziell erhältliches Mutanolysin und Lysostaphin können eingesetzt werden, um Peptidoglycanstrukturen zu spalten. Neben diesen beiden lytischen Enzymen charakterisierten wir die Atl Amidase, die ein alternatives Werkzeug zur Peptidoglycananalyse darstellt. Mutanolysin, Lysostaphin und Amidase können separat oder zusammen verwendet werden, um Muropeptide, Stammpeptide oder Zuckerreste für die Untersuchung von Signalaktivitäten in Wirtszellen zu isolieren.