Untersuchung über eine mögliche Beteiligung der Cdc7-Kinase bei der schnellen sauerstoffabhängigen Regulation der Replikon-Initiation in T24-Zellen

DSpace Repository


Dateien:
Aufrufstatistik

URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-25138
http://hdl.handle.net/10900/43856
Dokumentart: Dissertation
Date: 2006
Language: German
Faculty: 8 Zentrale, interfakultäre und fakultätsübergreifende Einrichtungen
Department: Interfakultäres Institut für Biochemie (IFIB)
Advisor: Probst, H.
Day of Oral Examination: 2006-09-20
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: Hypoxie , Replikation , Sauerstoff , Phosphorylierung
Other Keywords: 3H-Thymidin , Chromatin-gebundene , Reoxygenierung , T24-Zellen , Initiationshemmung
MCM2 , Cdc7 , Chromatin-bound , PD184352 , Rottlerin
License: Publishing license including print on demand
Order a printed copy: Print-on-Demand
Show full item record

Inhaltszusammenfassung:

Hypoxie führt in T24-Zellen zu einer reversiblen Hemmung der DNA-Replikation im „Hypoxischen-Präinitiationsstadium“, Nach Reoxygenierung erfolgt ein nahezu synchrones Anfluten der DNA-Replikation durch neue Replikon-Initiationen. Im erstem Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit die Cdc7-Kinase, deren Substrat MCM2 ist, eine Rolle bei der reversiblen Hemmung der Replikationsinitiation und ihrer Aufhebung nach Reoxygenierung spielt. Die erhaltenen Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass MCM2 nach Reoxygenierung phosphoryliert wird und gleichzeitig vom Chromatin abgelöst wird. Durch einen Phosphataseverdau ließ sich die Phoshorylierung bestätigen. Gleichzeitig wurde eine leichte Zunahme von Cdc7 nach Reoxygenierung gefunden. Durch Co-Immunopräzipitationsstudien wurde Cdc7 als möglicher Bindungspartner von MCM2 unter verschiedenen Inkubationsbedingungen ermittelt. In vitro Versuche, MCM2 durch Cdc7 zu phoshorylieren, scheiterten. Es stellte sich jedoch heraus, dass Cdc7 dabei selber phosphoryliert wird. Weitere Co-Immunopräzipitationsstudien wiesen daraufhin, dass neben Cdc7 auch Cdk2 co-präzipitiert wurde. Die in vitro Phosphorylierung von Cdc7 konnte mit Rottlerin teilweise inhibiert werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Cdk2 Cdc7 in vitro phosphoryliert. Die Zugabe von Rottlerin (3 h vor Reoxygenierung) in das Medium unter hypoxische Inkubation führte zu einer Inhibition von Cdk2 in vivo in T24-Zellen. Die Zugabe von Rottlerin (3 h vor Reoxygenierung) in das Medium unter Hypoxie hat keinen Einfluss auf chromatin-gebundenes Cdc7. Western-Blot-Analyse von MCM2 zeigt, dass es nach Reoxygenierung in mit Rottlerin inhibierten Zellen phosphoryliert und vom Chromatin abgelöst wurde. Analyse von chromatin-gebundenen PCNA und Sedimentations-analyse in alkalischen Sucrosegradienten ergaben, dass die Inhibition von Cdk2 mit Rottlerin keinen Einfluss auf die Initiation nach Reoxygenierung hat. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Kinase-Inhibitoren die reversible Hemmung der Replikationinitiation unter Hypoxie aufheben können. Es zeigte sich, dass PD184352 zu einem 3-4fach höherem Einbau von radioaktivem Thymidin führt. Die Analyse der Kettenlängen der wachsender Tochter-Stränge der DNA im alkalischen Sucrosegradienten ergab, dass PD184352 zu einer aktiven Replikation unter Hypoxie führt.

Abstract:

In response to several hours of hypoxia, T24 cells undergo a reversible arrest of replicon initiation at a ‘hypoxic pre-initiation state’, from which they enter into synchronous wave of replicon initiation when the oxygen concentration in the medium is re-elevated to a normal level. In the first part of the thesis, the possible role of Cdc7 kinase and of its substrate MCM2 in the molecular mechanism of reversible hypoxic arrest of replicon initiation and in its release after reoxygenation was studied. The results show that reoxygenation induces phosphorylation of chromatin bound MCM2 accompanied by its dissociation from the cellular chromatin. At the same time, a light increase of chromatin bound Cdc7 occurs. Co-immunoprecipitation experiments suggest that Cdc7 as a possible binding partner of MCM2. Attempts to phosphorylate MCM2 by Cdc7 in an in vitro kinase assay failed. However, Cdc7 itself thereby seemed to be phosphorylated and this reaction could be partially inhibited by Rottlerin. Furthermore, it was shown that Cdc7 from the chromatin fraction of the cells is co-immunoprecipitated with Cdk2. This indicates that the in vitro phosphorylation of Cdc7 possibly occurs by Cdk2. On the other hand, administration of rottlerin to the medium had no influence on the above mentioned changes of Cdc7 in living T24 cells. Western blot analysis of chromatin bound MCM2 indicated in vivo phosphorylation and dissociation from chromatin of MCM2 in cells inhibited with rottlerin as well as in uninhibited reoxygenated cells. Furthermore, alkaline sedimentation profiles of growing daughter strand DNA and the emergence of the proliferation marker PCNA in the chromatin fraction of hypoxic-reoxygenated cells revealed that inhibition of Cdk2 by rottlerin has no influence on the synchronous burst of DNA replicon initiation triggered by reoxygenation. The second part of the thesis analysed whether members of a collection of kinase inhibitors are able to release the reversible arrest of replicon initiation under persisting hypoxia. It was shown that PD184352 induces threefold increase of radioactive thymidine incorporation into the DNA of the hypoxic cells. Alkaline sedimentation analysis of the length distribution of pulse labeled daughter strand DNA confirmed that PD184352 induces regular DNA-replication in living hypoxic T24 cells, however, at a relatively low intensity compared to the effect of reoxygenation.

This item appears in the following Collection(s)