The MHC II ligandome : mass spectrometric applications in immunology

Abstract

The aim of this thesis was to establish a better knowledge of the human MHC class II peptide repertoire, the HLA ligandome, in general, and to outline a procedure which helps in the identification of class II-presented peptides from tumor associated antigens, in particular. To achieve these goals, biochemical and biomolecular methods as well as state-of-the-art mass spectrometric devices were used. To characterize the class II ligandome, HLA-DR peptides from the tumor-like cell line Awells, a human EBV transformed B lymphoblastoid cell line homozygous for HLA-DR4 – the HLA of interest –, were isolated and analyzed by MS using the rules of proteome analysis. 404 peptides with 173 different core sequences could be identified – the highest number of HLA ligands identified in a single experiment so far. Peptides from source proteins localized in virtually every cell compartment and participating in general cellular processes were presented under normal conditions on HLA class II molecules on the cell surface. In further experiments it could be shown that autophagy, a process involved in endosomal/lysosomal degradation and playing a role in tumor development, had a substantial impact on the class II ligandome. Cells undergoing autophagy over-presented class II peptides from intracellular source proteins by up to 131% in average as quantified by LC-MS. Thus, intracellular source proteins reach via autophagy the endosomal/lysosomal system and are there processed, corresponding peptides are loaded on class II molecules and presented on the cell surface. Posttranslationally modified naturally presented class II ligands could also be identified. Deamidated, cysteinylated and glycosylated HLA-DR peptides were characterized showing for the first time that naturally presented class II peptides can carry complex N-linked glycans. Finally, a strategy for the identification of naturally presented class II ligands from tumor associated antigens was set up. Fusion proteins targeting antigens of interest into the class II processing compartment were expressed in cells and the corresponding HLA-DR peptides isolated. By a differential mass spectrometric approach an HLA-DR4 ligand from cyclin D1 containing a CD4+ T cell epitope could be identified.

Ziel dieser Arbeit war es ein besseres Verständnis des HLA Klasse II Peptid-repertoires, dem so genannten Klasse II Ligandom, herzustellen. Insbesondere sollte eine Methode entwickelt werden, die die Charakterisierung von HLA Klasse II-Liganden Tumor-assoziierter Antigene ermöglicht. Um diese Vorgaben zu erfüllen, wurden neben molekularbiologischen und biochemischen Methoden moderne massenspektrometrische Technologien eingesetzt. Zur Charakterisierung des Klasse II-Ligandoms wurden HLA-DR-Liganden von der Tumor-Zelllinie Awells, einer EBV-transformierten humanen B-lymphoblastoiden Zelllinie, die homozygot für HLA-DR4 ist, isoliert. Es konnten 404 unterschiedliche Peptide mit 173 Kernsequenzen, die bisher höchste Anzahl an identifizierten HLA-Liganden in einem einzigen Experiment, beschrieben werden. Eine Proteom-Analyse ergab, dass Peptide von Quellproteinen aus nahezu allen subzellulären Kompartimenten auf HLA-DR präsentiert werden. Des Weiteren nehmen die Quellproteine an generellen zellulären Mechanismen teil. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass Autophagie, eine spezielle Form des endosomalen/lysosomalen Abbauweges, unter anderem involviert in der Tumorentwicklung, einen großen Einfluss auf das Klasse II-Peptidrepertoire hat. Autophagische Zellen überpräsentierten Peptide aus intrazellulären Quellproteinen durchschnittlich um 131%. Dies konnte mittels LC-MS gezeigt werden. Über Autophagie werden intrazelluläre Quellproteine in das endosomale/lysosomale System geschleust und dort abgebaut. Entsprechende Peptide werden dann auf Klasse II-Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert. Zusätzlich konnten auch posttranslational modifizierte Peptide identifiziert werden. So wurden deamidierte, cysteinylierte und glycosylierte Peptide charakterisiert. Unter anderem gelang es zum ersten Mal die Struktur eines natürlich präsentierten Klasse II-Peptids, modifiziert mit einem N-gebundenen Hexasaccharid, aufzuklären. Zur Identifizierung Klasse II-präsentierter Peptide aus Tumor-assoziierten Antigenen wurden in Zellen Fusionsproteine exprimiert, die Tumor-assoziierte Antigene in den Klasse II-Prozessierungsweg leiten, um anschließend HLA-DR Liganden der entsprechenden Antigene zu isolieren. Mit Hilfe einer differenziellen massenspektrometrischen Analyse konnte so ein HLA-DR4-Ligand aus Cyclin D1, der ein T-Helferepitop enthält, identifiziert werden.