Endogene und tumorassoziierte MHC Klasse II-Liganden in humanen dendritischen Zellen

Abstract

Die Interaktion von T-Zell-Rezeptoren mit MHC II-Selbstpeptid-Komplexen auf dendritischen Zellen scheint nicht nur für verschiedene Phasen der T-Zell-Entwicklung, sondern auch für die Regulation der T-Zell-Reaktivität gegenüber Fremantigenen von fundamentaler Bedeutung zu sein. In der vorliegenden Arbeit wurden die HLA-DR-restringierten Selbstpeptide unreifer und reifer humaner dendritischer Zellen untersucht und mittels Nanoelektrospray LC-MS/MS über 200 Peptidsequenzen identifiziert. Es zeigte sich, dass die von unreifen und reifen DCs präsentierten Selbstpeptide weitgehend identisch waren und dass die Peptide aus Proteinen nicht nur endosomal/lysosomaler Kompartimente, sondern auch aus cytosolischen und nukleären Proteinen stammten. Wesentlicher Unterschied in den Peptidrepertoires war die starke, selektive Anreicherung von MHC II-CLIP-Komplexen in reifen DC. Der Grund für die Akkumulation von CLIP auf der Zelloberfläche reifer DCs liegt vermutlich in der während der DC-Maturierung erfolgenden deutlichen Reduzierung der Menge und katalytischen Aktivität von HLA-DM, welches für die CLIP-Freisetzung verantwortlich ist. CLIP wird zusammen mit exogenen Antigenpeptiden in Tetraspan-Mikrodomänen angereichert, für die eine Funktion in der T-Zell-Aktivierung beschrieben wurde, und ist Bestandteil immunologischer Synapsen. MHC II-CLIP-Komplexe auf der Zelloberfläche von DCs beeinflussen die Polarisierung naiver T-Zellen: Eine Erhöhung des Anteils CLIP-beladener MHC II-Moleküle auf der Zelloberfläche wirkt der TH1-Polarisierung entgegen und fördert die Enstehung des TH2 und TH0 Phänotyps. Offenbar handelt es sich bei CLIP um einen endogenen Peptidliganden, der die Art der T-Zell-Antwort gegenüber exogenen Antigenen modulieren kann.

Die Induktion und Aufrechterhaltung von Antitumor-Immunität erfordert die Aktivierung von CD4+-Helferzellen. Dazu werden in der Regel MHC II-restringierte, tumorspezifische Antigenepitope benötigt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode entwickelt, welche die direkte, d.h. T-Zell-unabhängige, massenspektrometrische Identifizierung von Antigenen erlaubt, die von Tumorzellen auf MHC II-Moleküle von DCs übertragen wurden. Es zeigte sich, dass Antigene besonders gut auf MHC II-Moleküle von DCs übertragen wurden und zu deutlichen Veränderungen im HLA-DR-Peptidrepertoire führten, wenn nekrotische Tumorzellen zusammen mit einem zusätzlichen inflammatorischen Stimulus in einer frühen Phase der DC-Maturierung als Antigenquelle eingesetzt wurden. Der effiziente Transfer von Antigenen aus nekrotischen Tumorzellen auf DCs, könnte durch freigesetzte Hitzeschock-Proteine vermittelt werden, die bestimmte MHC II-Epitope binden. Mit Hilfe dieser Methode gelang die Identifizierung eines neuen, tumorspezifischen T-Helferzell-Epitops. Durch differentielle Nanoelektrospray LC-MS/MS-Analyse ungepulster versus mit nekrotischen Tumorzellen gepulster DCs konnte das erste MHC-II-Epitop des melanomspezifischen Proteins Melanotransferrin, Melanotransferrin(668-684), identifiziert werden. Das Epitop erwies sich als guter Ligand für unterschiedliche HLA-DR-Moleküle und konnte eine spezifische CD4+-T-Zell-Antwort induzieren. Zudem konnte es als endogener MHC II-Ligand auf einer MHC II-positiven, Melanotransferrin-exprimierenden Melanomzellinie nachgewiesen werden. Neben seiner melanomspezifischen Expression konnte für Melanotransferrin auch eine spezifische Überexpression in Lungen- und Colon-Karzinomen gezeigt werden, so dass das identifizierte Epitop als aussichtsreicher Kandidat für den Einsatz in Vakzinierungen angesehen werden kann.

Self-peptide-MHC II recognition on dendritic cells by T-cell receptors plays a role at all stages of T-cell development and seems to be of fundamental importance for the regulation of T-cell reactivity against foreign antigen as well.

In this study HLA-DR restricted self-peptides of immature and mature human dendritic cells were analyzed via Nano-LC-MS/MS and more than 200 peptide sequences were identified. Self-peptides presented by immature and mature dendritic cells were largely identical and derived from proteins of endosomal/lysosomal compartments but also from cytosolic and nuclear proteins.

The major distinction in the self-peptide repertoires was the selective upregulation of MHC II molecules occupied by the self-peptide CLIP on mature DCs - a phenomenon that is apparently due to the significant down-regulation of HLA-DM activity upon maturation.

CLIP is enriched together with exogenous antigenic peptides in tetraspan microdomains, which have been described to play a role in T-cell activation, and localizes to DC-T-cell synapses. The rise in CLIP-MHC class II complexes favours polarization of autologous naïve T cells towards the unpolarized and TH2 phenotype, thereby antagonizing TH1 polarization. Thus, self-peptide CLIP appears to be a key regulator on DCs involved in balancing cytokine responses of T helper cells.

Induction and maintenance of anti-tumor immunity depends on the activation of specific CD4+-helper cells. Therefore MHC class II restricted tumor specific antigens are required.

In the present dissertation a method is introduced which allows the direct, T-cell independent identification of antigenic epitopes, which were transferred from tumor cells onto MHC class II molecules of dendritic cells, via mass spectrometry. Changes in the peptide repertoire were most prominent if antigen was provided by necrotic tumor cells in an early stage of maturation together with an inflammatory stimulus. The efficient transfer of antigens via necrotic tumor cells might be mediated by heat shock proteins, which were shown to bind certain MHC class II peptides.

The identification of a novel, tumor specific T-helper epitope via this method is described. Differential nanospray LC-MS/MS analysis of unpulsed DCs versus DCs pulsed with necrotic tumor cells led to the identification of the first MHC class II epitope of the melanoma specific protein melanotransferrin, melanotransferrin (668-684). The identified epitope showed promiscuous binding to several HLA-DR types, proved to be immunogenic and was as well presented by a MHC class II positive, melanotransferrin expressing tumor cell line.

Melanotransferrin is not only expressed on melanoma but also specifically over- expressed in certain lung as well as colon carcinoma. The identified epitope can therefore be seen as a promising candidate to be included in tumor vaccination trials applying tumor specific MHC peptides.