Integrative Multi-Omics Analyses of the Cancer Tissue Microbiome

Abstract

Die Dissertation ist gesperrt bis zum 29. Januar 2028 !

Lange Zeit galt Tumorgewebe als steril. Inzwischen ist jedoch bekannt, dass es von Bakterien besiedelt sein kann, die sowohl den Krankheitsverlauf als auch das Thera- pieansprechen beeinflussen können. Die Erforschung dieser mikrobiellen Populatio- nen ist jedoch schwierig: Ihre Biomasse ist extrem gering, es fehlen standardisierte Methoden und ihre biologische Funktion ist bislang unzureichend beschrieben. Daher werden bisherige Erkenntnisse kontrovers diskutiert. Um diese Herausforderungen zu überwinden habe ich im Rahmen meiner Doktorarbeit ein integriertes Analysekonzept entwickelt um die Charakterisierung tumorassoziierter Bakterien sowie deren Wech- selwirkung mit molekularen und zellulären Tumoreigenschaften bei kolorektalen und Leberkarzinomen zu untersuchen. Durch einen systematischen Vergleich verschiedener Sequenzier- und taxonomischer Klassifizierungsmethoden konnte das Gewebemikrobiom des kolorektalen Karzinoms (CRC) als validierte Referenz für Proben mit geringer bis mittlerer mikrobieller Biomasse etabliert werden. Die charakteristische Mikrobiom-Signatur von CRC ließ sich am zuverlässigsten mit der Voll-Längen-16S-rRNA-Gensequenzierung (FL16S-seq) und einem neu entwickelten dualen RNA-Sequenzierungsprotokoll (HMR-seq) er- fassen. Bei diesem Protokoll wird gleichzeitig das Wirts-Transkriptom erfasst, um eine integrierte Analyse von Mikrobiom und Genexpression zu ermöglichen. Multi-Omics-Analysen, die 16S-rRNA-Gensequenzierung, ungerichtete Metabolomik und Transkriptomsequenzierung beinhalten, zeigten, dass intratumorale Bakterien mit spezifischen molekularen Programmen assoziiert sind. Die Gattungen Streptococcus und Selenomonas korrelierten mit den Signalwegen von Interferon, TNF-α und IL6-JAK-STAT3, wohingegen Fusobacterium mit proliferativen, zellzyklusbezogenen Programmen assoziiert war, die MYC- und E2F-Zielgene umfassen. Räumlich aufgelöste Analysen mittels Xenium Transkriptomsequenzierung kombiniert mit multiplexer mikrobieller Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung zeigten eine primäre Anreicherung von Bakterien im Tumorepithel und in tertiären lymphoiden Strukturen. Mit Bakterien assoziierte Tumorzellen zeigten zudem einen dedifferenzierten, stamm- zellähnlichen Transkriptionszustand mit erhöhter Expression von NOTCH1, LGR5, OLFM4 und RNF43. Die Anwendung dieses methodischen Rahmens auf Lebertumoren offenbarte mikro- bielle Signaturen in hepatozellulären Karzinomen (HCC), intrahepatischen Integrative Multi-Omics Analyses of the Cancer Tissue Microbiome III Kurzzusammenfassung Cholangiokarzinomen sowie kolorektalen Lebermetastasen (CRLM). Allerdings war die mikrobielle Biomasse geringer als bei CRC. Während im CRLM-Gewebe vor allem Darm- und Mundkeime angereichert waren, dominierten in primären Leberkarzinomen Gat- tungen, die im Darmmikrobiom seltener vorkommen. Diese enthalten jedoch Arten, die mit chronischen Infektionen des Menschen assoziiert sind. In HCC korrelierte die bakterielle Besiedlung mit proinflammatorischen Signalwegen. Bestimmte Gattungen, darunter Lactococcus sp., waren zudem mit dem Ansprechen auf Immuntherapie as- soziiert. Zusammenfassend etabliert diese Arbeit einen einheitlichen methodischen Rahmen für die hochauflösende Analyse von Mikrobiom–Wirts-Interaktionen in Proben mit geringer mikrobieller Biomasse. Daraus werden testbare Hypothesen abgeleitet, die die Rolle von Bakterien als integralen Bestandteil des Tumormikromilieus unterstreichen.

Tumor tissues, once considered sterile, are now known to harbor bacteria that influence cancer progression and therapy response. However, since studying these low-biomass tumor microbiomes is challenging due to a lack of methodological standards, contami- nation risks, and limited understanding of their biological roles, many findings remain controversial. To address these challenges, I developed an integrative framework to characterize tumor-resident bacteria and their interactions with host tumor features in colorectal and liver cancers as part of my PhD studies. Benchmarking of sequencing assays and taxonomic profilers established the colorectal cancer (CRC) tissue microbiome as a validated reference for low- to medium-biomass profiling. Full-length 16S rRNA gene sequencing (FL16S-seq) and a newly developed dual-readout RNA sequencing (RNA-seq) protocol, termed HMR-seq, most accurately recovered the CRC microbial signature while simultaneously providing host transcrip- tomic data for joint analysis of microbial composition and host gene expression. Multi-omics analyses of CRC tumor tissues combining 16S-seq rRNA gene sequencing, untargeted metabolomics, and bulk transcriptomics revealed that tumor-resident bac- teria associate with distinct molecular programs. I found genera such as Streptococ- cus and Selenomonas to correlate with interferon, TNF-α, and IL6–JAK–STAT3 signaling, whereas Fusobacterium abundance was associated with proliferative and cell-cycle- related programs involving MYC and E2F targets. Integrative spatial analysis using Xenium spatial transcriptomics and multiplexed mi- crobial fluorescence in situ hybridization showed that bacteria preferentially localize within the tumor epithelium and tertiary lymphoid structures. Bacteria-associated tu- mor cells exhibited a de-differentiated, stem-like transcriptional state marked by ele- vated NOTCH1, LGR5, OLFM4, and RNF43 expression. Extending this framework to hepatic cancers revealed microbial signatures across hep- atocellular carcinoma (HCC), intrahepatic cholangiocarcinoma, and colorectal cancer liver metastasis (CRLM), albeit at lower biomass than in CRC. While CRLM tissues were enriched for gut- and oral-derived taxa, primary liver cancers were dominated by gen- era not typically seen in the gut microbiome, yet comprising species capable of (per- sistent) human infection. Bacterial load in HCC correlated with pro-inflammatory path- ways, and specific taxa, including Lactococcus sp., were linked to immunotherapy re- sponse. Together, this work establishes a unified framework to pinpoint microbe–host interac- tions in low-biomass samples at the cellular and molecular level and generates testable hypotheses highlighting the role of bacteria as an important component of the tumor microenvironment.