Effects of secretomes from early and late passages of jaw periosteum derived stem cells on neuronal differentiation

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde systematisch untersucht, wie eine lange Zellkultivierung, die in der Induktion der replikativen Seneszenz resultiert, die biologischen Eigenschaften und das neuroregenerative Potenzial von Sekretomen aus Kieferperiostzellen (Jaw Periosteum Cells, JPCs) beeinflusst. Durch die Kombination von Seneszenzcharakterisierung, proteomischer Analyse und funktionellen neuronalen Assays konnte gezeigt werden, dass zelluläre Alterung die parakrine Signalumgebung von JPCs grundlegend verändert und ihre Fähigkeit zur Unterstützung neuronaler Regeneration moduliert. Erstens führte eine verlängerte in-vitro Expansion zur Ausbildung eines replikativen Seneszenzphänotyps in JPCs, der durch eine verminderte Proliferationsfähigkeit, erhöhte SA-β-Gal-Aktivität, gesteigerte p16-Expression sowie die Aktivierung von Faktoren des seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyps (SASP) gekennzeichnet war. Bemerkenswerterweise schien dieser seneszente Zustand überwiegend p16-dominiert zu sein und ging nicht mit einer anhaltenden Aktivierung der p53/p21-Achse oder einer signifikanten Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) einher. Dies spricht für eine stabilisierte replikative Seneszenz und nicht für eine akut stressinduzierte vorzeitige Alterung. Zweitens zeigte die proteomische Analyse eine ausgeprägte Umgestaltung des JPC-Sekretoms im Verlauf der Seneszenz. Frühe Passagen der JPCs wiesen eine Anreicherung von Signalwegen auf, die mit der Organisation der extrazellulären Matrix, Integrin-Signalübertragung und Zytoskelettregulation assoziiert sind. Demgegenüber war das Sekretom spätpassagierter JPCs durch eine verstärkte Repräsentation entzündungsassoziierter, immunologischer und stressbezogener Signalwege charakterisiert. Diese Ergebnisse weisen auf einen funktionellen Wandel von einem matrixunterstützenden und wachstumsfördernden sekretorischen Profil hin zu einem entzündungs- und stressassoziierten Phänotyp im Rahmen der replikativen Alterung. Drittens belegten funktionelle Analysen, dass diese Umstrukturierung des Sekretoms direkte biologische Konsequenzen hat. Während sowohl früh- als auch spätpassagierte Sekretome im Vergleich zu Kontrollbedingungen die neuronale Differenzierung unterstützten, förderte ausschließlich das Sekretom frühpassagierter JPCs signifikant das neuronale Überleben und das Neuritenauswachsen. Diese Befunde legen nahe, dass replikative Seneszenz die neuroprotektive Aktivität nicht vollständig aufhebt, jedoch selektiv strukturelle und trophische Unterstützungsfunktionen beeinträchtigt, die für eine effektive neuronale Regeneration essenziell sind. Zusammenfassend etabliert diese Arbeit einen mechanistischen Zusammenhang zwischen replikativer Seneszenz, Sekretom-Umprogrammierung und veränderter neuroregenerativer Wirksamkeit. Da passageabhängige replikative Seneszenz ein in-vitro Korrelat zunehmenden biologischen Alters darstellt, unterstreichen die Ergebnisse die Bedeutung des zellulären biologischen Alters als entscheidenden Faktor für die Qualität des JPC-Sekretoms. Die vorliegenden Befunde verdeutlichen die Notwendigkeit, Passagenzahl und Seneszenzstatus bei der Entwicklung sekretombasierter regenerativer Therapien gezielt zu kontrollieren. Durch die Aufklärung der seneszenzbedingten Veränderungen der extrazellulären Signalumgebung liefert diese Arbeit eine konzeptionelle Grundlage für die Optimierung Periostzell-basierter parakriner Strategien in der neuralen Regeneration.

This study systematically investigated how prolonged in vitro culturing finally inducing replicative senescence influences the biological properties and neuroregenerative potential of jaw periosteum cell (JPCs)-derived secretome. By integrating senescence characterization, proteomic profiling, and functional neuronal assays, we demonstrate that cellular aging profoundly reshapes the paracrine landscape of JPCs and alters their capacity to support neural repair. First, prolonged in vitro expansion induced a replicative senescence phenotype in JPCs, characterized by reduced proliferative capacity, increased SA-β-gal activity, elevated p16 expression, and activation of senescence-associated secretory phenotype (SASP) factors. Notably, this senescent state appeared predominantly p16-driven and was not accompanied by sustained p53/p21 activation or significant ROS accumulation, consistent with stabilized replicative senescence rather than acute stress-induced aging. Second, proteomic analysis revealed extensive remodeling of the JPC secretome during senescence. Early-passage JPCs exhibited enrichment of pathways associated with extracellular matrix organization, integrin signaling, and cytoskeletal regulation, whereas late-passage JPCs showed increased representation of inflammatory, immune-related, and stress-responsive pathways. These findings indicate a functional shift from a matrix-supportive and growth-permissive secretory profile toward an immune- and stress-associated phenotype during replicative aging. Third, functional assays demonstrated that this secretome remodeling has direct biological consequences. While both early- and late-passage secretomes supported neuronal differentiation relative to baseline conditions, only early-passage JPC secretome robustly promoted neuronal survival and neurite extension. These results suggest that replicative senescence does not abolish neuro-supportive activity but selectively compromises structural and trophic support functions that are critical for effective neural regeneration. All in all, this study establishes a mechanistic link between replicative senescence of JPCs, secretome reprogramming, and altered neuroregenerative efficacy. Since passage-dependent replicative senescence represents an in vitro correlate of increasing biological age, our findings highlight cellular biological age as a critical determinant of JPC secretome quality. These results underscore the importance of controlling passage number and senescence status in the development of secretome-based regenerative therapies. By delineating how senescence reshapes the extracellular signaling environment, this work provides a conceptual framework for optimizing periosteum-derived paracrine strategies in neural repair applications.